白血病G6PD蛋白表达的研究

蒋 剑，李永萍，潘 云，李正金，王红霞

（大理学院附属医院，云南大理 671000）

白血病G6PD蛋白表达的研究

蒋 剑，李永萍*，潘 云，李正金，王红霞

（大理学院附属医院，云南大理 671000）

目的：观察白血病患者骨髓中白血病细胞葡萄糖-6磷酸脱氢酶（G6PD）蛋白的表达情况，探讨G6PD与白血病的关系。方法：应用免疫组化方法检测35例白血病患者和35例非恶性血液病患者骨髓组织标本中白血病细胞G6PD蛋白的表达，比较白血病患者和非恶性血液病患者G6PD蛋白表达率的差异。结果：G6PD蛋白在白血病骨髓组织白血病细胞中呈现弱阳性表达。35例白血病患者骨髓组织中G6PD蛋白阳性表达率为25.7% （9/35），而35例非恶性血液病患者骨髓组织中G6PD蛋白阳性表达率为2.9%（1/35），差异有统计学意义（P<0.05）。结论：白血病可能存在G6PD蛋白的表达上调，值得进一步研究。

G6PD蛋白；白血病；免疫组化

白血病(leukemia)是造血干细胞的恶性克隆增生性疾病。我国的发病率约为2.76/10万，在儿童及35岁以下成人的恶性肿瘤中居第1位。葡萄糖6-磷酸脱氢酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD，EC1.1.1.49)存在于所有组织和细胞中，G6PD由G6PD基因编码，G6PD基因是典型的看家基因，定位于染色体Xq28。在人类由于G6PD基因突变，酶活性降低所引起的红细胞G6PD缺乏症是一组累及全球4亿人的遗传性溶血性疾病。

G6PD是肿瘤研究的热点之一。国内李瑞岩等〔1〕发现G6PD蛋白在胶质瘤中的表达上调，且与胶质瘤病理分级相关。G6PD也被认为是一个很好的治疗靶点。Kuo等〔2〕将G6PD高表达的NIH 3T3细胞注射到裸鼠皮下可快速诱导裸鼠产生肿瘤，而且肿瘤的大小与G6PD活性高低相关。并观察到谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成抑制剂—丁硫氨酸亚矾胺（Buthionine-S-R-sulfoximine，BSO）能抑制高表达G6PD的NIH 3T3细胞集落形成率。朱月春等〔3〕构建的G6PD缺陷型人皮肤黑色素瘤A375的稳转细胞，G6PD活性明显降低，尽管可以存活，但其生长速度明显减慢，单细胞克隆形成能力降低，凋亡细胞数增加。提示G6PD缺陷可明显抑制肿瘤细胞的生长和增殖。伊马替尼极具临床应用前景的原因之一是其除了能抑制BCR-ABL基因的激活，还能降低白血病细胞G6PD的活性，从而抑制白血病细胞生长〔4-5〕。由上可见，G6PD与肿瘤的发生、发展及治疗均有关系，抑制G6PD的活性能够有效抑制肿瘤细胞的生长。

大量研究表明：白血病患者外周血中红细胞G6PD活性也存在改变〔6-8〕，但白血病细胞中G6PD蛋白表达的研究却少见报道，为了探明白血病细胞G6PD蛋白的表达，以期为白血病的诊断、治疗和预后提供实验依据，应用免疫组化的方法检测了35例白血病患者的骨髓组织中白血病细胞的G6PD蛋白，现将研究结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象 收集我院病理科2008年4月至2010年10月共70例存档骨髓活检组织蜡块，病例组35例经临床诊断和骨髓病理活检确诊为白血病,按FAB分型标准分为：急性髓细胞白血病AML-M1型3例，AML-M2型6例，AML-M3型5例，AML-M4型1例，AML-M5型1例，AML-未分型1例，急性混合细胞白血病1例，急性淋巴细胞白血病5例，慢性粒细胞性白血病9例，慢性淋巴细胞白血病3例。其中男性22例，女性13例，年龄12～82岁，中位年龄46岁。对照组35例为临床诊断和骨髓病理活检均证实为非恶性血液病患者，其中男性19例，女性16例，年龄10～73岁，中位年龄49岁。

1.2 主要试剂和方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人G6PD多克隆抗体（购于武汉博士德公司）；PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒（购于北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色剂（购于福州迈新公司）。

1.2.2 方法 标本均为10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续4μm切片。石蜡切片常规脱蜡、水化，高压锅热修复抗原。3%H2O2室温避光孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；分别滴加适当的兔抗人G6PD多克隆抗体，37℃孵育2 h；滴加聚合酶辅助剂，37℃孵育20min，滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体试剂，37℃孵育20min。以上每步均用PBS冲洗3 min，3次；加DAB显色剂显色；自来水充分冲洗、苏木精衬染、脱水透明、中性树脂封片，镜下观察。本实验均用已知阳性片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定标准 免疫组化结果进行半定量分析。细胞质着色呈棕黄色为阳性表达，阳性细胞率＜10%记为阴性；阳性细胞10%~25%为+；阳性细胞25%~50%为++；阳性细胞>50%为+++。

1.4 统计学分析 所有资料经SPSS11.5统计软件包进行χ2检验。

2 结果

白血病细胞中G6PD的表达用免疫组化检测到35例白血病患者骨髓组织标本中有9例呈阳性表达，阳性率为25.7%，35例对照组骨髓组织标本仅有1例G6PD呈阳性表达，阳性率为2.9%；差异有统计学意义（P=0.006）。见表1，图1、2。所有G6PD的表达都为弱阳性。

表1 G6PD蛋白在白血病细胞中的表达

图1 增生性贫血G6PD表达阴性（免疫组化，×400）

图2 急性早幼粒细胞白血病G6PD表达弱阳性（免疫组化，×400）

3 讨论

G6PD是磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）的限速酶，其活性决定6-磷酸葡萄糖进入磷酸戊糖途径的流量。该酶主要受NADPH/NADP+比例的影响，其比例升高，磷酸戊糖旁路被抑制，比例降低时则被激活。磷酸戊糖途径为生物体提供还原型辅酶Ⅱ（reduced form of nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH）和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate，R-5-P）。其中NADPH是生物体内主要还原物质之一，广泛参与细胞内信号转导、抗氧化应激等，而5磷酸核糖是细胞增殖过程中合成核苷酸不可缺少的原料，是肿瘤细胞快速增殖的需要。

1975年Bovin〔6〕最早报道白血病患者红细胞G6PD的活性减低，在25例AML中有2例G6PD活性减低，同时发现9例儿童AML的G6PD活性均增高。钱镜秋等〔7〕观察了G6PD活性与病情关系，凡酶活性增高或虽不增高甚或降低但能恢复正常者，均易获得缓解，反之酶活性降低而又不能恢复者则不易获缓解。张学军等〔8〕的研究则显示AML活动期G6PD活性较正常明显降低，缓解期无明显恢复；ALL各期均无显著变化。但是Sharma等〔9〕在67例白血病患者中并没有发现红细胞G6PD的活性发生改变。以上研究可能提示了白血病红细胞的G6PD活性改变规律：AML的G6PD活性以降低为主，ALL以增高为主，且大多发生在初治或复发阶段，在缓解阶段G6PD活性可恢复正常。

本研究发现白血病细胞中G6PD蛋白呈阳性表达（9/35），而对照组中仅有1例感染性疾病患者骨髓细胞G6PD蛋白呈阳性表达，提示白血病细胞中G6PD蛋白的表达上调。Batetta等〔10〕研究显示：不管是G6PD缺乏还是G6PD正常的白血病细胞，与外周血单核细胞相比，其G6PD活性均明显增高。G6PD缺乏的白血病患者与G6PD正常的白血病患者相比G6PD基因呈高水平表达。白血病细胞中G6PD蛋白表达上调的具体机制尚不清楚，可能为〔10-11〕：①白血病细胞快速增殖过程中需要增加G6PD蛋白的表达，从而使进入磷酸戊糖途径进行代谢的葡萄糖增加，使白血病细胞能利用代谢中间体合成ATP和某些底物进行大分子的合成；②白血病细胞通过增加G6PD蛋白表达来上调磷酸戊糖途径以增强抗氧化能力，从而更利于细胞存活。

本文承蒙大理学院附属医院病理科毕磊等老师提供实验技术指导，谨此致谢！

〔1〕李瑞岩，蒋传路.脑胶质瘤中G6PD蛋白的表达及与肿瘤分级的相关性〔J〕.哈尔滨医科大学学报,2008,42（5）:497-499.

〔2〕KuoW Y,Lin JY,Tang TK.Human glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)gene transforms NIH 3T3 cells and induces tumors in nudemice〔J〕.Int JCancer,2000,85（6）:857-864.

〔3〕朱月春,吕会茹,李丹怡,等.siRNA沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及凋亡的影响〔J〕.生物化学与生物物理进展,2008,35(3):327-334.

〔4〕Boren J,Marta C,Silvia M,eta1.Gleevec（STI571）influencesmetabolic enzyme activities and glucose carbon flow toward nucleic acid and fatty acid synthesis inmyeloid tumor cells〔J〕.JBiol Chem,2001,276（41）:37747-37753.

〔5〕Gottschalk S,Anderson N,Haim C,eta1.Imatinib（STl571）-mediated changes in glucose metabolism in human leukemia BCR-ABL-positive cells〔J〕.Clin Cancer Res,2004,10（4）:6661-6668.

〔6〕Boivin P,Galand C,Hakim J,et al.Acquired erythroenzymopathies in blood disorders:study of 200 cases〔J〕.Br JHaematol,1975,31（4）:531-543.

〔7〕钱镜秋,吴月芳,徐杰.小儿白血病红细胞PK、G6PD活性测定的临床意义〔J〕.临床儿科杂志,1991,9（4）:213-214.

〔8〕张学军,徐世荣,姚尔固,等.急性白血病患者红细胞丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性改变〔J〕.中华血液学杂志,1995,16（6）:316-317.

〔9〕Sharma S,PatiHP.Erythrocyte enzyme abnormalities in leukemias〔J〕.JAssoc Physicians India，2006,54:453-457.

〔10〕Batetta B,PulisciD,Bonatesta RR,etal.G6PD activity and gene expression in leukemic cells from G6PD-deficientsubjects〔J〕.Cancer Lett，1999,140（1/2）:53-58.

〔11〕邱嘉斌,何玲.基于瓦博格效应的肿瘤治疗新策略〔J〕.药学进展,2009,33（9）:385-395.

（责任编辑 张 焕）

Expression of G6PD P rotein in L eukem ia

JIANG Jian,LIYongping*,PAN Yun,LIZhengjin,WANG Hongxia
（Affiliated Hospital of DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To investigate the expression of G6PD protein in human leukemia and analyze the relationship between G6PD and leukemia.MethodsImmunohistochemical method was applied to detect the expression of G6PD protein in the bone marrow tissue of 35 leukemia patients and 35 cases of non-hematologic malignancies.Non-hematologic malignancies were used as control group.The comparison of G6PD protein rate in leukemia patents and the controlwas studied.ResultsThe positive expression rate of G6PD protein was 25.7%（9/35）in leukemia patients and 2.9%（1/35）in control.Data showed a statistically significant difference in G6PD expression between the two groups （P<0.05）.ConclusionG6PD protein was high expressed in leukemia,which needed further study.

G6PD protein;leukemia;immunohistochemistry

R733.7

A

1672-2345（2011）02-0027-03

2011-01-02

蒋剑，2008级硕士研究生，主要从事血液病基础与临床研究.

*通信作者：李永萍，教授，电话：0872-2253090