外源性野生型p53基因对sw1990细胞调控基因表达的影响

朱春晖，谢 勇，吕农华

南昌大学第一附属医院消化研究所南昌330006

(2010-09-19收稿 责任编辑 赵秋民)

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，我国胰腺癌发病率逐年上升，3 a生存率不足10%，5 a生存率低于5%［1］。p53作为基因组卫士，是目前已知的与肿瘤相关性最高的抑癌基因。2000年首次提出了 p53 基因 网 络 的概 念［2］，p21waf1/cip1、bax、mdm2、puma及pten是该基因网络中的关键基因，它们除了发挥各自的功能外，同时相互作用以调节细胞的正常生理活动。作者通过将野生型p53质粒导入胰腺癌sw1990细胞中，观测细胞内调控基因的mRNA及蛋白表达情况，探讨利用野生型p53质粒治疗胰腺癌的可能性及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常胰腺组织6例，为江西省肿瘤医院手术标本。获取的每例标本快速置于冰上称重，切割成100 mg左右的组织块，分装于液氮罐中保存，并送病理活检，所有研究对象均签署知情同意书。胰腺癌sw1990细胞株由上海第二军医大学长海医院屠振兴教授惠赠。重组质粒p53-GFP为美国印第安纳大学卢华教授惠赠。LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)，质粒小提试剂盒(Tiangen公司)、Trizol、M-MLV、dNTP(Promega 公司)，各种抗体(Santa Cruz公司)，荧光试剂盒(Pierce公司)，DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，琼脂糖(Amresco公司)，其余试剂为国产分析纯。

1.2 sw1990细胞培养 使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育培养sw1990，0.5 g/L胰蛋白酶溶液消化贴壁生长的成纤维细胞并传代［3］。

1.3 sw1990细 胞 和 正 常 胰 腺 组 织 中 p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 及 mdm2 mRNA 表达的RT-PCR检测 按Trizol试剂盒说明提取总RNA。PCR上下游引物序列见表1。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离检测。用 Bandscan图像分析软件进行吸光度积分值分析，以目的基因与βactin(内参照)的吸光度积分值之比作为各目的基因mRNA的相对表达量。

1.4 sw1990细胞和正常胰腺组织中 P53、BAX、PTEN及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达的Western blot检测 收集细胞和组织，提取蛋白并定量［4］。样品经凝胶电泳分离，电转移后，膜封闭 1 h，加入封闭液稀释的一抗［一抗分别按1∶400(P53)、1∶400(BAX)、1∶200(PTEN)、1∶200(p-AKT)稀释］，结合2 h。加封闭液稀释的二抗［山羊抗鼠lgG(按1∶1 000稀释);Actin山羊抗兔lgG(按1∶1 000稀释)］，反应 1.5 h。ECL显色，胶片曝光，显影、定影，扫描，读取各条带的斑点密度值，获得目的蛋白相对表达量。

1.5 重组质粒p53-GFP转染sw1990细胞 将sw1990细胞接种于6孔细胞培养板内，每孔细胞数2×105个，加4 mL培养液培养。待细胞培养板孔内的细胞覆盖率达70%时，于转染前2 h吸出培养液，用PBS液洗涤细胞2次，每孔加入2 mL不含血清的DMEM液。分别将重组质粒p53-GFP及空白质粒pEGFP-N1溶于不含胎牛血清、不含抗生素的DMEM中，使其终浓度为25μmol/L，同时将10μL LipofectamineTM2000加入不含胎牛血清、不含抗生素的DMEM中，室温孵育5 min后将质粒溶液加入，室温孵育20～25 min后，将上述混合液分别加入各组培养孔内，2 mL/孔，轻摇混匀;空白组加入无质粒无脂质体且不含血清、不含抗生素的DMEM 2 mL，转染后6 h，除去培养液，PBS液洗2遍，各孔加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 2 mL/孔，继续培养24 h，在荧光显微镜下观察转染效率，并收集成功转染p53-GFP质粒并表达野生型P53的带抗性基因的sw1990(sw1990/p53)细胞进行下列实验。

表1 PCR上下游引物序列及反应条件

1.6 转染细胞中 p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten和mdm2 mRNA及相应蛋白的表达 具体步骤同1.3 和 1.4。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0进行分析，应用两独立样本的t或t’检验比较不同组别和因素中p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 和 mdm2 mRNA 和相应蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 sw1990细胞与正常胰腺组织中增殖调控基因mRNA及相应蛋白的表达 见表2和表3。

2.2 稳定转染重组质粒p53-GFP的sw1990细胞及未处理细胞中增殖调控基因mRNA及相应蛋白的表达 见表4和表5。

表2 sw1990细胞与正常胰腺组织中p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 和 mdm2 mRNA 的表达

表3 sw1990细胞与正常胰腺组织中 P53、BAX、PTEN、p-AKT 的表达

表4 转染组与未处理组p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten 和 mdm2 mRNA 表达的比较

表5 转染组与未处理组中P53、BAX、PTEN和p-AKT表达的比较

3 讨论

正常情况下细胞的增殖和凋亡处于一个动态平衡，当细胞受到紫外线照射、离子辐射、化疗药物、蛋白激酶抑制剂及异常细胞生长信号等作用时，增殖凋亡相关基因表达失衡，信号传导通路发生异常，细胞不受监控地异常增殖并恶性转化，导致肿瘤的发生。享有分子警察之称的p53及其下游基因p21waf1/cip1、bax、puma、pten 及 mdm2 在其中发挥着重要作用。该实验研究表明，与正常胰腺组织相比，sw1990细胞中 p53、p21waf1/cip1、bax、puma和 pten mRNA 低表达，mdm2 mRNA 高表达，与徐刚等［2］研究结果一致。

sw1990细胞稳定转染重组质粒p53-GFP后，上述基因mRNA及蛋白表达升高，说明外源性野生型p53导入后，P53聚集在细胞内并转位至核，形成有生物学活性的四聚体，P53蛋白表达水平及其与DNA的亲和力增高，并促进共激活因子的招募和组蛋白的乙酰化［4］。有活性的P53与靶基因的 P53反应元件结合，可激活包括细胞周期抑制蛋白(P21Wafl［5］、14-3-3 δ 以 及 BTG)、促 凋 亡 蛋 白(BAX［6］、APAFl［7］、PUMA［8-9］、P53AIPI［10］、PIDD［11］和NOXA［12］)及DNA修复相关蛋白(核苷酸还原酶P53R)在内的下游调节蛋白，从而引起细胞周期阻滞、生长增殖抑制。

p53能直接结合 pten的上游序列形成 P53/PTEN复合物，该复合物以一种不依赖磷酸酶活性的机制增强p53的转录活性及其蛋白稳定性，从而延长P53的半衰期，使P53蛋白稳定化［13-14］。与此同时，PTEN还能通过PI3K/Akt信号通路抑制Akt的活化，从而阻止MDM2 Ser166磷酸化及核转位，并使之降解［15-16］;PTEN也可直接作用于 mdm2的启动子抑制其基因转录，降低MDM2蛋白水平［17］。

总之，该实验结果显示，重组人野生型p53基因的导入可能通过调节相关基因的表达，从而抑制胰腺癌sw1990细胞的增殖，这为野生型p53基因治疗胰腺癌提供了体外实验依据。

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