中风1号汤剂对急性脑出血大鼠NSE蛋白水平影响及改善神经功能缺损的实验研究

梁群，朱永志，杨滢，于倩，郝娟，刘茜

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血，属于中医学中出血性中风范畴，是严重危及人类生命健康的常见病、多发病，其患病率、致残率及病死率均较高，为患者家庭带来经济上和精神上双重的负担［1－2］。近年来，脑出血具有年轻化及逐年上升趋势。西医对脑出血的内科治疗主要集中在对症支持疗法上，如防治脑水肿、降低颅内压等等，但长期预后效果并不理想。近年来，中药干预治疗脑出血的研究取得了可喜的成绩［3］，本研究通过观察中风1号汤剂对大鼠急性脑出血神经缺损功能及脑水肿症状的改善，及中药干预前后血清NSE浓度的变化，初步探讨中医药治疗急性脑出血的疗效，从而为今后的中西医结合内科保守治疗提供一定的参考。

1 实验材料及方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，体质量(250±20)g，雄性，由黑龙江中医药大学实验动物中心提拱，按清洁级标准饲养。

1.2 主要仪器及试剂

大鼠脑立体定位仪(型号:TSE，德国进口);电热鼓风干燥箱(型号:CS101－2E，中外合资重庆四达实验仪器有限公司);电子天平，低速台式离心机(型号:TDL－80－2B，上海安亭科学仪器厂);10%水合氯醛溶液(天津市福晨化学试剂厂);大鼠神经特异性烯醇化酶(NSE)ELISA检测试剂盒(美国R＆D Systems);30%过氧化氢;聚维酮碘溶液;100ul微量注射器。

1.3 药物

中风1号汤剂主要由黄芪，当归，川芎等中药配伍而成(由黑龙江中医药大学附属一院提供的院内制剂);20%甘露醇(石家庄四药有限公司，规格:250ml/瓶，国药准字H1302303);肝素钠注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司，规格:12 500U/2ml，2ml×10支，批号0705105);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，规格:160万u/瓶，批号D0804310)。

2 实验方法

2.1 实验动物分组

将50只雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组10只，即中药组(中风1号组)、西药组(甘露醇组)、中西药联合组(中风1号联合甘露醇组)、假手术组、空白组。假手术组为对照组。分别观察各组动物用药前后神经功能缺损情况，以及第5天血清NSE水平的变化，并测定脑组织含水量。

2.2 造模

制备大鼠急性脑出血模型［4］。

1 )麻醉并固定:大鼠称取质量，用10%水合氯醛，以0.4uL/1g腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定向仪上;2)定位:备皮，局部消毒。正中纵行切口，30%双氧水腐蚀骨膜暴露前囟及进针点。靶点定位于前囟为0点、中线左侧旁开3mm、前囟后0.4mm，进针点处用牙科钻钻一个直径1mm圆孔至硬膜表面，勿钻通硬脑膜;3)取血及注血:剪尾取血，用微量进样器抽取血量67μL(因大鼠脑出血 1μL相当于人脑出血0.75mL，故上述出血量分别相当于人脑出血50mL)。血液静置5min使之半凝固。针头通过钻孔垂直缓慢进入脑内，并将凝固血快速注入靶点内(注射速度20μL/min)，并留针30min，拔针。局部涂用注射用青霉素钠，并缝合刀口。同时腹腔注射青霉素钠20万U，连续应用5天，防止术后感染而影响实验结果。

假手术组:造模方法同上，但是不向脑内注射血。

2.3 给药

大鼠的用药量按成人剂量与人体质量折算系数比公式计算［5］。

中药组:中风一号汤剂，1.5ml灌胃，2次/天。生理盐水1g/kg，2次/天股静脉注射。术后持续给药5天;西药组:生理盐水，1.5ml灌胃，2次/天。甘露醇1g/kg，2次/天股静脉注射。术后持续给药5天;中西药结合组:中风一号汤剂，1.5ml灌胃，2次/天。甘露醇1g/kg，2次/天股静脉注射。术后持续给药5天;假手术组:生理盐水，1.5ml灌胃，2次/天。生理盐水1g/kg，2次/天股静脉注射。术后持续给药5天;空白组:生理盐水，1.5ml灌胃，2次/天。生理盐水1g/kg，2次/天股静脉注射。术后持续给药5天。

2.4 造模成功评分

在所有动物麻醉完全清醒后(约术后3h)，参照Zea－Longa方法［6］进行各组大鼠神经功能缺损评分(Neurological deficit score，NDS)，分为5 分:

0 分:正常活动，无神经功能缺损;1分:将大鼠尾巴提起，瘫痪侧前肢不能充分伸展;2分:大鼠有向瘫痪侧偏转的行为;3分:向瘫痪侧倾倒;4分:不能行走，有意识障碍。

2.5 样品采集及血清NSE检测

10%水合氯醛麻醉，剖腹，腹主动脉取血4ml，并离心，参照说明书，采用酶联免疫分析法测定血清NSE水平。

2.6 脑组织含水量测定

10%水合氯醛麻醉，断头处死，开颅取脑，生理盐水冲洗后用滤纸吸尽脑表面血渍和水分，取出血灶周围约3mm脑组织置于电子天平上称湿重并记录，再将标本置于100℃恒温箱烘烤1天后再称干重。并按照Elliot公式计算:脑组织含水量(%)=(湿重－干重)/湿重×100%。

2.7 统计学处理

采用SPSS 13.0医学统计软件进行分析，实验数据用均数加减标准差(±s)表示，组间数据比较用方差分析。

3 实验结果

3.1 神经功能缺损评分

从表1可以看出，各组与假手术组比较，均有显著性差异(P＜0.01);前四组组间内比较无统计学意义(P＞0.05)，说明造模成功。

从表2可以看出，术后第5天，各组与假手术组比较，均有显著性差异(P＜0.01);各组与空白组比较，具有显著性差异(P＜0.01)，空白组NDS明显高于其他组;中药组、西药组与中西医结合组比较，具有显著性差异(P＜0.05);单纯中药组与单纯西药组比较，无统计学意义(P＞0.05)。

表1 术后0天大鼠NDS评分(±s)

表1 术后0天大鼠NDS评分(±s)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01。

NDS中药组 9 2.43 ±1.023组别n＊＊西药组 8 2.39 ±0.990＊＊中西医结合组 9 2.42 ±0.963＊＊空白组 9 2.40 ±0.680＊＊假手术组10 0.00 ±0.00

表2 术后5天大鼠NDS评分(±s)

表2 术后5天大鼠NDS评分(±s)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与空白组比较，△△P＜0.01;与中西医结合组比较，#P＜0.05。

NDS中药组 9 2.10 ±1.023＊＊△△#组别n 10 0.00 ±0.00西药组 8 2.08 ±0.982＊＊△△#中西医结合组 9 1.79 ±1.245＊＊△△空白组 9 3.27 ±0.530＊＊假手术组

3.2 血清NSE水平测定

从表3可以看出，术后第5天，各组与假手术组比较，均有显著性差异(P＜0.01);各组与空白组比较，具有显著性差异(P＜0.01)，空白组NSE水平明显高于各组;中药组、西药组与中西医结合组比较，具有显著性差异(P＜0.01);单纯中药组与单纯西药组比较，无统计学意义(P＞0.05)。说明中药组与西药组均可降低NSE含量，但两者之间无差异，而中西医结合组NSE含量显著降低，说明中西医结合组能有效减轻出血性中风大鼠急性期神经元损伤，并有改善预后作用。

表3 术后5天大鼠血清NSE水平(±s)

表3 术后5天大鼠血清NSE水平(±s)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与空白组比较，△△P＜0.01;与中西医结合组比较，##P＜0.01。

NSE中药组 9 19.07 ±2.62＊＊△△##组别n 10 6.34 ±1.31西药组 8 18.29 ±2.59＊＊△△##中西医结合组 9 12.82 ±1.72＊＊△△空白组 9 24.13 ±2.16＊＊假手术组

3.3 脑组织含水量测定

从表4可以看出，术后第5天，各组脑组织含水量与假手术组比较，均有显著性差异(P＜0.05);各组与空白组比较，也具有显著性差异(P＜0.05)，尤其是中西医结合组(P＜0.01)，说明空白组脑组织含水量明显高于各组;中药组、西药组与中西医结合组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，说明中西药结合组能明显降低脑组织含水量;单纯中药组与单纯西药组比较，无统计学意义(P＞0.05)。

表4 术后5天大鼠脑组织含水量(±s)

表4 术后5天大鼠脑组织含水量(±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与中西医结合组比较，#P＜0.05。

组别 n 脑含水量(﹪)中药组 9 79.42 ±0.89＊△#10 77.24 ±0.42西药组 8 79.35 ±0.77＊△#中西医结合组 9 78.76 ±1.72＊△△空白组 9 83.35 ±0.54*假手术组

4 讨论

烯醇化酶是参与糖酵解的关键酶，其普遍存在于生物体内的糖酵解代谢中，尤其是γγ型同功酶，其特异地存在于神经元和神经内分泌细胞内，故又称为神经元特异性烯醇化酶(NSE)［7］，正常条件下，NSE特异性地存在于神经元细胞浆内，当缺氧、缺血或中毒的情况下，神经元细胞膜的完整性遭到破坏，使NSE从细胞内漏到细胞外，进入细胞间隙，并进入脑脊液，再透过血脑屏障进入血管内，从而进入血液循环［8］。因此，有的学者认为，脑脊液和血清NSE水平可用来判断急性期脑出血病情程度及预后［9］。

脑水肿是脑出血的重要并发症，也是临床急性脑血管疾病病情加重和死亡的主要原因。脑出血引起颅脑损伤的机制中，脑组织水肿引起颅内压异常升高是首要因素，因此西医内科保守治疗急性脑出血，脱水降颅内压是最重要原则。所以，脑组织含水量的测定有对于判断药物治疗效果以及患者病情发展情况非常有意义。

中风1号是由黄芪、当归、川芎等中药配伍而成，具有益气活血，祛瘀通络，扶正之功效，是朱永志教授治疗急性脑出血临床经验的总结，是缓解急性期脑出血症状并改善患者预后的有效中药。

本研究显示，中风1号汤剂组，西药组及中西医结合组均对大鼠脑出血性损伤引起的神经功能缺损及脑水肿有明显改善作用，且能够明显降低血清NSE水平，尤其是中西医结合组，效果非常显著(P＜0.01)，而单纯中风1号汤剂组与单纯西药组比较，无统计学意义(P＞0.05)。推测其机制可能与中药改善脑出血后脑血流动力学，维护血脑屏障正常的通透性，稳定神经元细胞膜，减少组织渗出，减轻脑水肿及NSE的释放，从而具有保护神经组织，改善患者预后的作用。

［1］ 朱慧渊.运用“治未病”理论防治脑中风探析［J］.中医药学报，2010，38(6):6 －8.

［2］ 钞建峰，贾慧，孙风平.试述以“虚”为核心的中风病机观［J］.中医药学报，2011，39(2):67 －68.

［3］ 张友堂，陈磊.续命汤治中风新解［J］.中医药学报，2010，38(5):103.

［4］吕田明，陆兵勋.大鼠尾状核注射凝固自体动脉血脑出血模型［J］.中风与神经疾病杂志，2006，23(1):88－90.

［5］ 陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出社，1993:33－35.

［6］ Zea longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversibal middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84－91.

［7］ 关景霞，余绍祖，曾庆杏.神经元特异性烯醇化酶和S－100蛋白在脑血管疾病中的临床意义［J］.国外医学·脑血管疾病分册，2000，8(4):242 －244.

［8］ Barone FC，Clark RK，Price WJ，et al.Neuron － specific enolase in creases in cerebral and systenic circulation following focal insche mia［J］.Brain Res，1993，623:77 －82.

［9］ Schaarsschmidt H，Prange HW，Reiber H.Neuron specific enclose concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovas cular diseases［J］.Stroke，1994，25(6):558 －565.