改良IME－FICC法检测鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞及其临床意义分析*

蔡清清， 丁 颖， 林天歆， 黄慧强△

(1中山大学肿瘤防治中心内科，广东广州510060;2广东药学院附属第一医院肿瘤科，广东广州510080;3中山大学附属第二医院泌尿外科，广东广州510120)

广东省是全球鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)最高发的地区，目前广东省每年的鼻咽癌新发病例约5 000例，而我院每年的收治鼻咽癌新发病例约3 000例。颈淋巴结转移是目前判断NPC预后的重要因素。然而，颈淋巴结转移状态对预后的预测准确率并不理想，部分早期患者亦可出现远处转移，因此亟需寻找更有效的预测指标。大量基础和临床研究显示，外周血中检测到循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是一个潜在的预后因素，并在乳腺癌中得到临床证实[1－5]。我们既往的研究已经证实改良免疫磁珠富集及免疫荧光细胞化学方法(immunomagnetic enrichment and fluorescent immunocytochemistry，IME－FICC)检测乳腺癌外周血中的CTCs是一种简便、省时、敏感性及特异性均较高的方法[6，7]。本研究将改良 IME－FICC法应用于检测NPC患者外周血中的CTCs，并探索其临床意义。

材料和方法

1 临床资料

2008年1月－2008年12月，共收治76例初治鼻咽癌患者。所有入选病例均被临床检查及组织学或细胞学确诊为I－IVb期的鼻咽癌患者，分期标准按照2002年AJCC(American Joint Committee on Cancer)制定的关于肿瘤分期的标准，在抽血前均未接受任何治疗。76例鼻咽癌患者的病理类型均为WHO II/III型。I期接受根治性放疗，II－IVb接受含铂类的诱导化疗2－3疗程，后接受根治性的联合铂类的同期放化疗(鼻咽部66－70 Gy/6.5－7周;颈淋巴结阳性给予根治量60－70 Gy/6－7周;颈部淋巴结阴性给予预防量50－56 Gy/5－5.5周)，见表1。另取20例正常志愿者的外周血标本作为阴性对照。中位随访25(范围:5 －35)个月后，有17例患者复发，13例复发部位在鼻咽和/或颈部，3例发生远处转移，1例鼻咽和/或颈部+远处转移。7例死亡，均死于肿瘤复发。

表1 76例鼻咽癌患者临床特征Table 1.Clinical characteristics of NPC patients(n=76)

2 实验主要试剂及仪器

2.1 主要试剂 CNE1的鼻咽癌细胞株由美国ATCC细胞库提供。0.25%的胰酶、DMEM、胎牛血清和青霉素/链霉素购自 Life Technologies。Histopaque－1077购自 Sigma。

OncoQuest提供的上皮细胞回收试剂盒包括 :EpiSep玻片、免疫磁珠颗粒、生物素标记的抗细胞角蛋白(cytokeratin，CK)8/18抗体、碱性磷酸酶标记的链霉卵白素溶液、荧光悬液(含ELF－97)、DAPI、预洗缓冲液、终止缓冲液、乙醇固定剂、冲洗缓冲液、阳性对照(缓冲液中固定了的CNE1细胞)和阴性对照(缓冲液中固定了的正常供者的PBMC)。

2.2 仪器与设备 Beckman离心机，37℃、5%CO2细胞培养箱，超净台，低速旋转器和荧光显微镜及连接显微镜的数码相机和电脑。

3 方法[6，7]

3.1 共采集15 mL肝素抗凝静脉血(留取第2管血，以防止由于静脉穿刺把皮肤表皮细胞带进血管中而造成的假阳性结果)。使用Histopaque－1077，利用密度梯度原理，分离单个核细胞。使用一种磁珠颗粒与抗上皮细胞黏附分子(epidermal cellular adhesion molecule，EpCAM)的抗体结合以辨认表达EpCAM的单个核细胞。取50 μL磁珠颗粒加入950 μL细胞悬液中，孵育后使用特制的EpiSep玻片(玻片中央有一个椭圆形的加样孔，玻片被固定在磁铁板上，磁铁板的中央有一块长方形磁铁，则加样孔在磁铁正上方)。将混合物加到玻片的加样孔中。表达EpCAM的阳性细胞结合到磁珠上，被磁铁吸住。随后，用酒精固定，加生物素标记的抗CK8/18抗体孵育，加链亲和素－碱性磷酸酶溶液，孵育，洗涤。加荧光悬液(含ELF－97，一种酶标的荧光物质，是水溶性的，可发出弱蓝荧光。被碱性磷酸酶酶解后，不溶于水，被特定波长的光照射后，可激发出强绿荧光)孵育，洗涤。最后，用DAPI孵育，荧光标记胞核的双链DNA，洗涤。每次分析都使用CNE1细胞及正常人分离出的外周血单个核细胞分别作为阳性和阴性对照。

3.2 在荧光成像显微镜下分析CK8/18+细胞 本研究使用一部装备100W的汞灯作光源的荧光显微镜(Nikon)。为了区分DAPI发出的蓝荧光及ELF97酶解反应物发出的绿荧光，显微镜同时装备了2个滤板，一个窄波段滤板可用于检测DAPI发出的蓝荧光;另一个宽波段滤板可用于检测ELF97酶解反应物发出的绿荧光。移动滤板到不同位置，就可观察到被荧光染色的核发出的蓝荧光及CK8/18发出的绿荧光，并能观察到阳性细胞的形态学特征。使用装备在显微镜上的彩色数码相机成像，经SPOT Advanced 3.4 for Windows(Diagnostic Instruments)软件处理后，保存在计算机里。

4 病毒壳蛋白抗原(viral capsid antigen，VCAIgA)抗体滴度检测方法

VCA－IgA免疫酶染色检测试剂盒购自广东中山生物工程公司。待检血清用PBS从1∶5开始倍比稀释，按说明书操作，以阳性结果的最低血清稀释度作为血清内相应抗体的滴度[8]。

5 统计学处理

用SPSS 13.0软件包对数据进行统计分析。采用Kaplan－Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用log－rank检验。复发与否、转移与否、复发转移与否组间的CK8/1818 CTCs和VCA－IgA中位数比较采用Wilcoxon秩和检验。CK8/18+CTCs不同水平间2年无复发率及2年生存率的比较采用Fisher精确概率法。VCA－IgA＜1∶80和≥1∶80两组间2年无复发率和2年生存率比较采用卡方检验。CK 8/18+CTCs以及VCA－IgA不同水平间中位无复发时间和中位总生存时间比较采用Gehan法。无复发和生存的多因素分析采用Cox比例风险回归模型(Forward LR)。

结 果

1 鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞的形态特征

本研究使用这一检测方法分析了76例临床分期I－IVb期的初治鼻咽癌患者。图1显示了其中鼻咽癌患者外周血中的CK8/18+细胞，可见其表面覆盖多个磁珠，在宽波段滤板，其胞浆因表达CK8/18蛋白而被染上绿荧光，而胞核(因含dsDNA而被DAPI染色)呈现强白光，在窄波段滤板，可见原胞核位置被染上蓝荧光，且这一胞核较大，形状不规则，而周围的白细胞均未被染色。

2 检测鼻咽癌患者外周血CK8/18+肿瘤细胞的敏感性及特异性

76例鼻咽癌患者的外周血中有63例检测到CK8/18+细胞，阳性率为82.9%，20例正常志愿者外周血中无一例检测到CK8/18+细胞，两组差异显著(P＜0.01)。本实验方法检测外周血CK+肿瘤细胞的特异性为100%(20/20)。

3 治疗前检测的鼻咽癌患者外周血CK+肿瘤细胞和VCA－IgA抗体滴度对治疗后复发的影响

复发与否患者治疗前检测的外周血CK+CTCs中位数分别为5(四分位数间距范围5－6)和3(四分位数间距范围1－4)，P＜0.01，差异显著。但复发与否患者治疗前检测的中位VCA－IgA滴度无显著差异，见表2。

表2 复发与否患者治疗前CK8/18+循环肿瘤细胞及VCA－IgA抗体滴度对比Table 2.CK8/18+circulating tumor cells(CTCs)and VCAIgA antibody titers before treatment in the patients with(n=17)or without(n=59)relapse

4 治疗前检测的鼻咽癌患者外周血CK+肿瘤细胞对鼻咽癌患者复发率的影响

63例治疗前外周血检测到CK+肿瘤细胞的患者有17例治疗后复发(27.0%)，而13例治疗前没检测到 CK+肿瘤细胞的患者无1例复发(P＞0.05)。

治疗前VCA－IgA滴度≥1∶80患者的复发率为25.0%(3/12)，而VCA－IgA滴度＜1∶80的复发率为21.9%(14/64)，P＞0.05。

5 生存率分析

治疗前没有检测到外周血CK+肿瘤细胞患者的2年无复发生存率100%，治疗前检测到外周血CK+肿瘤细胞个数分别为1、2、3、4、5、6 的患者 2 年无复发生存率分别为 100%、100%、94.1%、71.4%、53.3%、44.4%，差异显著(P＜0.01)，外周血CK+肿瘤细胞个数在3以上，无复发生存率逐渐下降;治疗前没有检测到外周血CK+肿瘤细胞及检测到CK+肿瘤细胞个数分别为1、2、3、4、5、6 的患者 2 年总生存率分别是 100%、100%、100%、100%、100%、80.0%、77.8%(P＞0.05)，外周血CK+肿瘤细胞个数在5以上，总生存率逐渐下降，见图2。

治疗前VCA－IgA＜1∶80及≥1∶80患者的2年无复发生存率分别为77.8%和80.6%(P＞0.05)，2年总生存率分别为88.9%和94.0%(P＞0.05)，均无显著差异，见图3。

6 单因素分析及Cox多因素分析

单因素分析结果显示治疗前外周血CK+CTCs的检测个数明显影响了鼻咽癌患者的无复发生存率(P＜0.01)，把治疗前CK+CTCs的检测个数及患者的临床参数纳入Cox多因素分析模型中，结果显示外周血CK+CTCs的检测个数是影响患者无复发生存最重要的预后因子[P＜0.01;hazard ratio(HR)=3.320;95% confidence interval(CI)=2.073－5.318]，另外，疗效及临床分期也是影响患者无复发生存的重要的预后因子，见表3。

Figure 1.Circulating tumor cells detected in the peripheral blood of patients with nasopharyngeal cancer(×400).A:one CK8/18+cell was observed with long－pass UV filter;B:the cell nucleus(blue fluorescence)stained by DAPI was visible with narrow －pass UV filter.图1 鼻咽癌患者外周血中检测到的循环肿瘤细胞

Figure 2.Relapse－free survival(A)and overall survival(B)with different numbers of CK+CTCs.图2 CK+CTCs的无复发生存曲线及总生存曲线

Figure 3.Relapse－free survival(A)and overall survival(B)with different levels of serum VCA － IgA titers.图3 不同血清VCA－IgA滴度的无复发生存曲线及总生存曲线

表3 无复发生存的Cox多因素分析Table 3.Summary of relapse－free survival analyses by multivariate Cox proportional hazards model(n=76)

总生存的单因素分析结果显示治疗前外周血CK+CTCs的检测个数、年龄、疗效、临床分期明显影响了鼻咽癌患者的总生存(分别为 P＜0.01、P＜0.05、P ＜0.01、P ＜0.05);把治疗前 CK+CTCs的检测个数及患者的临床参数纳入Cox多因素分析模型中，结果显示外周血CK+CTCs的检测个数及年龄是影响患者总生存的重要预后因子(P＜0.05;HR=3.639;95%CI=1.303－10.158;P=0.050;HR=5.190;95%CI=1.001－26.904)，见表4。

表4 总生存的Cox多因素分析Table 4.Summary of overall survival analyses by multivariate Cox proportional hazards model(n=76)

讨 论

远处转移是NPC治疗失败的主要原因，颈淋巴结转移是目前判断NPC预后的重要因素。然而，颈淋巴结转移状态对预后的预测准确率并不理想，部分早期患者亦可出现远处转移，因此亟需寻找更有效的预测指标。大量基础和临床研究显示，外周血中检测到的肿瘤细胞是一个潜在的预后因素[1－5]。

检测实体肿瘤微转移的方法主要有免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)、分子生物学技术(PCR等)及流式细胞学技术。目前为止，ICC仍是检测上皮性恶性肿瘤患者骨髓与外周血中微转移细胞的最普遍、最成熟、最标准的方法。而检测癌症患者骨髓或外周血中肿瘤细胞最广泛使用的标志物就是CK，是表皮细胞或表皮细胞来源的癌细胞胞浆内的细胞骨骼蛋白的主要组成成分。已有大量临床研究证实，CK是检测乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和喉鳞癌的一个特异性较高的标志物[9，10]。我们的前期研究结果显示在ICC的基础上，将传统的免疫磁珠富集及免疫荧光细胞化学技术结合应用，使用特制的专有EpiSep玻片和荧光双标循环肿瘤细胞技术，其敏感性较高，可在107的外周血单个核细胞中检测到1个肿瘤细胞，且简单、快捷，特异性高达100%，在正常人的外周血中未检测到CK8/18+细胞，与上述方法比较，该方法具有较高的敏感性和特异性[6，7]。本研究也在正常人的外周血中未检测到CK8/18+细胞，进一步验证了该方法的特异性。

本研究使用改良IME－FICC法检测治疗前鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞，比较了复发与否患者治疗前检测的鼻咽癌患者外周血CK+CTCs中位数，两者差异显著。但复发与否患者治疗前检测的中位VCA－IgA滴度无显著差异。外周血CK+肿瘤细胞个数在3以上，无复发生存率逐渐下降。外周血CK+肿瘤细胞个数在5以上，总生存率有下降趋势，但未达统计学差异。VCA－IgA滴度不能预测生存。Cox多因素分析结果也一样。

其他一些学者亦报道了使用类似检测方法检测恶性肿瘤外周血循环肿瘤细胞的研究结果。Liu等[11]对转移性乳腺癌(MBC)系统治疗期间CTCs和FDG－PET/CT监测的预测价值进行了比较。开始新的一系列治疗并且在基线以及治疗期间9到12周(治疗中)接受了CTCs计数和FDG－PET/CT扫描检查的MBC患者进行了一项回顾性分析。按照治疗中CTCs计数结果[好(＜5个CTCs/7.5 mL血液)或差(≥5个CTCs/7.5 mL血液)]，对患者进行了分类。对治疗中的CTCs计数和FDG－PET/CT反应进行了比较。结果发现在102名可评价的患者中，中位总生存时间是14个月(范围:1到＞41个月)。在102名可评价患者的68名(67%)中，治疗中CTCs水平与FDG－PET/CT反应有关。在单变量分析中，治疗中CTCs计数和FDG－PET/CT反应可预测总生存期(分别P＜0.01和P＜0.01)。在34名治疗中CTCs少于5个的不一致患者中的31名(91%)，FDG－PET/CT可预测总生存期(P＜0.01)。在多变量分析中，仅治疗中CTC水平保持显著(P＜0.01)。该研究结果显示除了代谢反应之外，治疗监测期间检测到5个或更多的CTCs可准确预测MBC的预后。Okegawa等[12]使用CellSearch系统(另一种免疫磁珠富集结合荧光双标方法)，对循环肿瘤细胞是否能够预测激素难治性前列腺癌患者的生存期进行了评价。此系统利用基于上皮细胞黏附前列腺癌抗体的免疫磁性捕捉和自动染色方法开发。对从64名激素难治性前列腺癌患者采集的血样进行了分析。结果显示在64名患者中，32名患者(50%)有至少5个循环肿瘤细胞，他们的中位总生存期是13.0个月，而循环肿瘤细胞数量少于5个的患者中位总生存期为20.0个月(P＜0.01)。根据单变量分析和多变量分析，循环肿瘤细胞和前列腺特异性抗原倍增时间是预测总生存期有意义的参数。与在开始循环肿瘤细胞检测之后，从肿瘤细胞水平未升高转变为升高的患者相比，从升高转变为未升高的患者，总生存期较长(P＜0.05)。该研究结果表明循环肿瘤细胞可能是激素难治性前列腺癌患者总生存期的独立预测因素。

由于早中期鼻咽癌患者的生存期较长，到本研究截止时间(2010年12月31日)，76例患者中位随访时间25个月，最短5个月，最长35个月，目前大部分患者仍在随访当中，经过初步统计分析结果显示外周血中的CK8/18+循环肿瘤细胞是初治鼻咽癌患者较重要的预后因子，仍需进一步扩大病例数及延长随访时间，进一步验证外周血中CK+循环肿瘤细胞在初治鼻咽癌患者的临床意义。该方法经验证后可成为国际上预测鼻咽癌复发及血道转移早期诊断的标准，并有利于指导该类患者采用何种治疗方案并观测疗效。

总的来说，我们使用前期发展的这个新的检测循环肿瘤细胞的方法，初步验证了鼻咽癌患者循环肿瘤细胞阳性率与患者无复发生存及总生存有关，而VCA－IgA滴度不能预测生存。到目前为止，国内外还未见到类似的报道。

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