平台扫描仪结合ImageJ软件测定番茄叶面积

高建昌 郭广君 国艳梅 王孝宣 杜永臣

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

平台扫描仪结合ImageJ软件测定番茄叶面积

高建昌 郭广君 国艳梅 王孝宣 杜永臣*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

利用扫描仪获取标准图形，对ImageJ软件测定番茄叶面积的准确性进行了验证。发现不同的扫描分辨率（100、200和300DPI）对图形面积没有显著影响，200DPI的分辨率为较好的扫描参数。以番茄叶片为试材，对剪纸法与图像处理法进行比较，发现二者差异不显著。在此基础上，建立了一种扫描仪结合ImageJ软件测定番茄叶面积的方法。

扫描仪；ImageJ；图像处理；分辨率；番茄；叶面积

叶片是植物地上部与外部环境进行交互的重要部分，是植物进行光合作用、蒸腾作用和呼吸作用的主要器官。而叶面积是生理生化、遗传育种以及作物栽培的重要测定指标。叶面积的准确测定对于深入研究光合效率、蒸腾速率和逆境胁迫等生理指标有重要意义。

目前常用的叶面积测定方法主要有光电测定法、剪纸法、打孔测定法、排水量测定法、系数测定法、数格测定法等（乔富廉，2002），各有优缺点。近年来，随着数码照相技术以及计算机图像处理软件发展，研究者建立了一些基于数码照相和扫描仪结合 Photoshop软件测定叶面积的方法（肖强 等，2005；李宝光 等，2006；石景荪 等，2007）。相比传统的方法，利用电脑软件测定植物叶面积受人为因素影响较小，叶片形状、颜色、厚薄等对测定结果无显著影响；同时测定方法快速简便，适用范围广。

基于图像处理软件测定叶面积主要是通过分析图片的分辨率（DPI，Dot Per Inch，指单位长度内的像素数目，1英寸=2.54 cm）来实现的。ImageJ（V1.43）（Wayne Rasband，2010）是由美国国家心理健康研究所的Wayne Rasband博士开发的一款图像处理和分析软件，该软件可以处理TIFF、GIF、JPEG、BMP、DICOM、FITS等图像格式，能实现对图片像素的获取直接输出叶面积大小。相比采用Photoshop软件，步骤简单，无需编程就可实现大量样品的处理，更为快捷。

本试验旨在探讨采用扫描仪和ImageJ软件测定番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）叶面积的准确性，建立一种可以快速处理大量番茄叶面积的方法。

1 材料与方法

1.1 扫描仪和ImageJ软件测定标准图形面积

标准图形的制备:采用Photoshop或其他软件绘制4个面积不等的正方形和4个面积不等的直角三角形，黑色填充，用直尺测量边长，记录，计算每个图形的面积。

扫描仪采用HP M1522n，分别以100DPI、200DPI、300DPI进行扫描。

ImageJ测定面积步骤如下:打开ImageJ软件，Open打开目标文件；Analyze/Set scale，设定对话框；Image/color/split channels，采用Blue通道进行下一步；Image/Adjust/Threshold，红色自动填充；Analyze/Analyze Particles，设定对话框，点击“OK”输出结果。

1.2 试验验证

取完全展开的番茄叶片3片，将其平铺于两片透明胶片纸之间，扫描，利用ImageJ软件统计叶面积，3次重复。将扫描照片打印，称质量（打印纸质量记为W总），测量A4纸面积（记为S总），沿叶缘将图像准确剪下，称质量（质量记为W测）。按照比例计算出叶面积，计算公式为S测=W测/W总×S总。3次重复。

1.3 数据分析

采用Excel软件进行数据汇总，利用DPS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同分辨率对面积测定的影响

分辨率是决定扫描仪获取图片数字图像像素数目的最主要因素，有研究表明图片像素随扫描仪分辨率的提高呈几何级数增长（李宝光 等，2006），而图像处理软件是通过获取像素来测定面积的，在一定范围内分辨率会对面积有一定的影响。为了确定分辨率对面积测定的影响，本方法采用自制色块图形进行研究。在一张A4纸上用Photoshop软件绘制4个大小不等的正方形和4个直角三角形，分别用100DPI、200DPI和300DPI的分辨率扫描3次，ImageJ软件测定面积。利用DPS软件进行统计分析，Duncan新复极差法进行多重比较，结果如表1。

从表1可以看出，不同分辨率对测定同一图形的面积没有显著影响，试验中仅在测定Tri4面积时发现采用300DPI扫描的图片面积与100DPI和200DPI存在显著差异，但没达到极显著水平，可能为机械误差所致。而且300DPI扫描的图片面积较其他两种方式偏大。同时，比较变异系数可以看出，图片面积越小，变异系数越大，具体原因尚不清楚。

较低的分辨率意味着较快的扫描速度，但会损失一定的扫描精度。在分辨率对面积影响无显著差异的情况下，本试验认为采用200DPI进行面积测定为较好的选择。

2.2 图像处理方法与图形测量方法的比较

将2.1中绘制的图片打印3份，分别测量8个图形的边长，计算其面积。将结果与200DPI扫描后计算的图片面积进行比较（表2）。两种方法差异不显著，说明基于扫描仪结合ImageJ软件测定图片面积是可行的，而且图像处理方法较图形测量方法的变异系数偏小，说明采用图像处理方法误差更小，更准确。

表1 扫描仪分辨率对面积测定的影响

表2 不同面积测定方法的比较

2.3 试验验证

本试验中对传统的剪纸法进行了改进，首先利用扫描仪扫描叶片，然后打印再沿叶缘进行裁剪称质量。

分别用图像处理法（200DPI）和剪纸法测定相同的3片番茄叶片，结果如表3。结果显示两种方法在测定番茄叶面积时差异不显著，即图像处理法是切实可行的。并且采用图像处理法较传统的剪纸法变异系数更小，说明图像处理法稳定性更好。

表3 不同测定方法测定番茄叶面积

3 结论与讨论

3.1 扫描仪结合ImageJ软件测定番茄叶面积的方法

综合上述试验结果，笔者建立了一种扫描+软件分析的番茄叶面积测定方法，具体如下。

① 扫描:选取待测番茄叶片，平铺于两张透明胶片纸之间，采用 HP M1522n（或其他扫描仪）以200DPI的分辨率进行扫描，保存文件（建议保存为JPEG格式）。

② ImageJ软件分析步骤:

Ⅰ打开文件:

Ⅲ Image/color/split channels

此处将待测叶片分成红（Red）、绿（Green）和蓝（Blue）三个通道，任选一个即可。本试验选取蓝（Blue）通道进行分析。

Ⅳ Image/Adjust/Threshold

本步骤自动用红色块将待测叶面积填充。

Ⅴ Analyze/Analyze Particles

此方法用于计算叶面积，点击后按下图所示进行设置。如果需要计算总面积，可勾选Summarize。点击OK，输入结果。该结果可以保存也可直接复制粘贴至Excel表中进行处理。

3.2 讨论

在传统的叶面积测定方法中，除叶面积仪法和叶面积系数法外，其他方法都是在破坏植物组织的基础上进行的。本试验中由于采用了平台扫描仪，同样对植物叶片进行了破坏性取样。但是如果采用数码相机（外加标尺）或者手持式扫描仪取样，就可以避免破坏植物组织。

本试验用简单实用的剪纸法与图像处理法进行比较，发现剪纸法虽然简单，但受叶片形状、纸张均匀度以及人为因素影响较大，尽管采用打印的方法替代手工描绘，但人为剪纸的精度对结果影响较大，变异度偏高。对于大量的样品，则费工费力。叶面积仪是公认的较好的方法，但叶面积仪一次性投入过高，即便是便携式叶面积仪其测定结果受扫描速度影响过大，从而限制了其普及推广。图片像素分析结合图像处理软件是较为理想的方法，国内的研究者研究了利用Photoshop软件进行叶面积分析的方法，但其方法过于繁琐，需要人工选取目标区域，增加了人为误差，同时采用Photoshop软件不能对测定结果进行自动记录和自动输出，影响了其应用。ImageJ软件则克服了上述问题，所有步骤均有电脑自动完成，仅需简单的设置就可以完成对大量样品的处理（Tiago & Wayne Rasband，2010），同时可以自动输出计算结果，便于进一步分析，更为快捷。

李宝光，陶秀花，倪国平，黄冬华，宋小民.2006.扫描像素法测定植物叶面积的研究.江西农业学报，18（3）:78-81.

乔富廉.2002.植物生理学实验分析测定技术.北京:中国农业科学技术出版社:67-70.

石景荪，左启华，张涛，张立峰，边秀举.2007.图像处理技术在唐菖蒲叶面积测定中的应用.中国农学通报，23（5）:456-460.

肖强，叶文景，朱珠，陈瑶，郑海雷.2005.利用数码相机和Photoshop软件非破坏性测定叶面积的简便方法.生态学杂志，24（6）:711-714.

Tiago A F，Wayne Rasband.2010.http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf.

Wayne Rasband.2010.http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html.

Measuring Plant Leaf Area by Scanner and ImageJ Software

GAO Jian-chang, GUO Guang-jun, GUO Yan-mei, WANG Xiao-xuan, DU Yong-chen*
（Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100081, China）

The accuracy of measuring tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）leaf area by ImageJ software was confirmed through measuring scanned standard shape. There was no significant difference for area with100,200 and300 DPI. And200 DPI was better. Two methods of paper-cutting and image processing for measuring tomato leaf area were compared and there was no significant difference. Based on the result, the method of measuring tomato leaf area with scanner and ImageJ software was established.

Scanner; ImageJ software; Image processing ; DPI; Tomato; Leaf area

S641.2

A

1000-6346（2011）02-0073-05

2010-09-04；接受日期:2010-11-01

国家自然科学基金项目（30900987），国家“973”项目子课题（2009CB009004-02），中国农业科学院基本科研业务费项目，农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室

高建昌，男，助理研究员，专业方向:蔬菜遗传育种，E-mail:gaojch@mail.caas.net.cn

*通讯作者（Corresponding author）:杜永臣，男，研究员，博士生导师，专业方向:蔬菜遗传育种，E-mail:yongchen.du@mail.caas.net.cn