XRCC1和XRCC3单核苷酸多态性与晚期非小细胞肺癌铂类药物化疗疗效的相关性

许崇安 王小杰 张晔 李琳

铂类药物（顺铂或卡铂）是治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的重要药物，其与长春瑞滨、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛任一联合的两药方案对NSCLC患者化疗的有效率相似[1]，与非铂类方案相比，含铂两药方案化疗能够延长NSCLC患者的生存期，并提高其生活质量[2]，含铂两药方案现已成为治疗进展期NSCLC的标准一线方案。铂类药物主要通过损伤DNA而导致细胞死亡[3]，而机体的DNA损伤修复系统可以修复这类损伤，从而影响铂类药物化疗的敏感性。由于个体之间对DNA损伤后的修复能力有很大的差异[4,5]，因此，常可导致即使同样是NSCLC，甚至是病理类型和临床分期相同的患者采用相同的治疗方案，其治疗效果和不良反应却明显不同。DNA修复基因的过表达及DNA修复基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）可改变DNA修复能力，因此，检测DNA修复基因的SNP可以预测个体肿瘤化疗的敏感性和预后。

X线修复交错互补基因1（X-ray repair cross complementing gene 1, XRCC1）是DNA碱基切除修复和单链断裂修复系统中的重要成分，参与铂类药物等引起的DNA修复过程，该基因编码区存在导致氨基酸取代的SNP，这些SNP影响XRCC1的活性[6,7]。虽然许多功能性研究已报告了XRCC1对肿瘤的影响，但其SNP与NSCLC铂类药物化疗敏感性关联的研究结果却不尽相同。X线修复交错互补基因3（X-ray repair cross complementing gene 3, XRCC3）是Rad51 DNA修复基因家族成员，虽然在DNA双链断裂同源性重组修复中扮演重要角色[8]，但其Thr241Met位点的SNP与铂类药物化疗敏感性的关系尚不清楚。本研究报告130例晚期NSCLC患者XRCC1和XRCC3的SNP以及它们与铂类药物化疗疗效的关系，为个体化化疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2008年8月-2010年3月中国医科大学附属第四医院收治的经病理证实的初治晚期NSCLC患者130例，其中男性90例，女性40例，均为汉族；中位年龄62（28-83）岁；吸烟80例，不吸烟50例；腺癌76例，鳞癌46例，其它类型8例；临床分期：IIIb期58例，IV期72例；ECOG PS评分：0分44例，1分86例。所有患者均有可测量病灶并均接受了2个-6个周期（平均4个周期）含铂两药方案化疗。具体化疗方案如下：长春瑞滨+铂类（顺铂或卡铂）82例，吉西他滨+铂类26例，紫杉醇类（紫杉醇或多西他赛）+铂类22例。

1.2 样本收集 血液标本在患者知情同意的情况下，于化疗前抽取静脉血5 mL，静置后取血凝块并提取DNA，将提取的DNA置于-20oC低温冰箱中备用。

1.3 疗效评定 所有患者均经含铂两药方案化疗2个周期后根据RECIST标准评定疗效，分为完全缓解（complete response, CR）、部分缓解（partial response, PR）、疾病稳定（stable disease, SD）和疾病进展（progressive disease,PD）。客观缓解=CR+PR，未缓解=SD+PD。

1.4 基因型分析 采用PCR-RFLP方法进行XRCC1、XRCC3基因型检测。引物序列及扩增片段大小见表1。25 μL PCR反应混合液中含1 μL DNA、0.4 μmol/L引物各1 μL、0.1 mmol/L dNTP 2 μL、Taq聚合酶0.125 U、5×反应缓冲液5 μL。PCR反应条件: 95oC预变性5 min；95oC 45 s，61oC 45 s，72oC 45 s，35个循环；72oC延伸10 min。分别取5 μL PCR产物与相应的核酸内切酶37oC温育过夜，XRCC1 Arg194 Trp、Arg399 Gln及XRCC3 Thr241 Met核酸内切酶分别为PvuII、NciI和NlaIII。3.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。随机抽取30%样本，双盲法重复检测加以验证，结果完全一致。

1.5 统计分析 应用SPSS 17.0进行统计学分析，采用χ2检验或Fisher's精确概率法比较不同基因型之间化疗疗效的差异，采用非条件Logistic回归分析计算优势比（odds ratio,OR）及其95%可信区间（confidence interval, CI）评价不同基因型及多态位点间联合与疗效的相关性。所有检验均为双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效分析 130例晚期NSCLC患者经含铂两药方案化疗2个周期后，CR 0例，PR 44例（33.8%），SD 54例（41.6%），PD 32例（24.6%），化疗总有效率为33.8%（44/130）。

2.2 基因分布 130例晚期NSCLC患者，在XRCC1 Arg-194Trp位点中，携带Arg/Arg、Arg/Trp和Trp/Trp基因型患者分别为54例（41.5%）、40例（30.8%）和36例（27.7%）。在XRCC1 Arg399 Gln位点中，携带Arg/Arg、Arg/Gln和Gln/Gln基因型患者分别为66例（50.8%）、54例（41.5%）和10例（7.7%）。在XRCC3 Thr241 Met位点中，携带Thr/Thr和Thr/Met基因型患者分别为114例（87.7%）和16例（12.3%），未检测到Met/Met纯合突变基因型。

2.3 基因型与化疗疗效的关系 从表2可见，携带XRCC1 194 Arg/Arg、Arg/Trp和Trp/Trp基因型NSCLC患者的化疗有效率分别为22.2%、35.0%和50.0%，有明显差异（χ2=7.478, P=0.024）。携带Trp/Trp基因型患者的化疗有效率是Arg/Arg基因型携带者的3.5倍（P=0.006）。携带至少1个Trp等位基因（Arg/Trp和Trp/Trp基因型）患者的化疗有效率至少是携带Arg/Arg基因型患者的2.5倍（P=0.018）。携带XRCC1 399 Arg/Arg、Arg/Gln和Gln/Gln基因型患者的化疗有效率分别为45.5%、25.9%和0，携带XRCC1 399 Arg/Arg基因型患者的化疗有效率明显高于其它基因型携带者。携带XRCC3 241 Thr/Thr与Thr/Met基因型患者化疗有效率分别为31.6%和50.0%，二者无统计学差异（P=0.145）。

年龄、性别、吸烟、病理类型及临床分期与晚期NSCLC患者化疗敏感性均无统计学关联（P＞0.05）。

2.4 XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln多态联合作用与化疗疗效的关系 我们进一步分析了XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln两个位点基因型联合与化疗疗效的关系，结果显示，XRCC1 194和399多态之间在化疗敏感性方面存在明显相互作用，同时携带XRCC1 194Arg/Arg和399Gln/Gln基因型的10例患者无一例有效，而携带至少1个XRCC1 194 Trp等位基因同时又携带XRCC1 399 Arg/Arg基因型者的化疗有效率明显高于同时携带194 Arg/Arg和399 Arg/Gln基因型者（表3）。

2.5 XRCC1与XRCC3联合基因型与化疗疗效的关系 本研究进一步分析了XRCC1与XRCC3两个基因不同多态基因型联合与化疗敏感性的关系，发现XRCC1与XRCC3多态之间在化疗敏感性方面存在明显的相互作用；携带至少1个XRCC1 194 Trp等位基因和399 Arg/Arg野生型基因同时又携带XRCC3 241 Thr/Met基因型者的化疗有效率明显高于其它基因型携带者（表4）。

3 讨论

人类细胞中存在大量DNA修复基因，它们对某些类型的DNA损伤具有特异性修复能力，对避免基因突变、维护基因组的稳定性和完整性具有重要的作用。许多DNA修复基因具有SNP，导致氨基酸替代的SNP可能改变修复酶的活性，并且可能是导致个体DNA损伤修复能力差异的重要原因[9]。研究[10]表明，DNA修复能力与肿瘤易感性密切相关，DNA修复能力低肿瘤易感性高；而在肿瘤治疗过程中，DNA修复能力的增加却阻碍了疗效的发挥，肿瘤细胞的DNA修复能力与化疗敏感性密切相关。

XRCC1的SNP可影响XRCC1蛋白的正常功能，从而影响DNA修复能力[11]。XRCC1 SNP与铂类药物化疗敏感性相关，携带XRCC1 194 Trp等位基因的NSCLC患者对铂类药物化疗敏感，而携带Arg/Arg基因型患者对铂类药物化疗失败的风险几乎是携带至少1个Trp等位基因患者的3倍。携带至少1个XRCC1 399 Gln等位基因的患者对铂类药物化疗失败的风险是399 Arg/Arg携带者的2.7倍。而且XRCC1 194和399这两个位点的SNP存在联合作用，同时携带194 Arg/Trp和399 Arg/Arg基因型患者对铂类药物化疗的敏感性更高[12]。洪成雨等[13]研究结果显示，仅XRCC1 194基因多态与NSCLC患者铂类药物化疗的敏感性相关，而Arg399 Gln基因多态与化疗敏感性无关，而且XRCC1 194和399两个位点的SNP也无联合作用。姚成云[14]和赵万[15]的研究虽然证实了XRCC1 399基因多态与NSCLC患者铂类药物化疗敏感性相关，但其结果却显示，携带XRCC1 399 Gln突变基因患者的化疗反应率反而明显高于399 Arg/Arg野生型基因携带者。

表 1 PCR引物及扩增片段大小Tab 1 PCR primers and product sizes

表 2 XRCC1和XRCC3基因型与NSCLC化疗敏感性的关系Tab 2 The relationship between XRCC1 and XRCC3 genotypes and chemosensitivity of NSCLC

表 3 XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln多态联合与化疗疗效的关系Tab 3 Interaction of XRCC1 Arg194 Trp and XRCC1 Arg399 Gln polymorphisms on the chemotherapy response

表 4 XRCC1和XRCC3联合基因型与化疗疗效的关系Tab 4 Associations of XRCC1 and XRCC3 genotypes with the efficacy of chemotherapy

本研究结果表明，XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln两个位点的SNP均与NSCLC患者铂类药物的化疗敏感性密切相关。携带XRCC1 194 Trp纯合突变基因患者的化疗有效率是Arg/Arg野生型基因携带者的3.5倍（P=0.006）。携带至少1个Trp等位基因患者的化疗有效率至少是携带Arg/Arg基因型患者的2.5倍（P=0.018）。携带XRCC1 399 Arg/Arg野生型基因患者的化疗有效率明显高于其它基因型携带者。XRCC1 194和399两个位点基因多态之间在化疗敏感性方面存在明显的相互作用，携带至少1个XRCC1 194 Trp等位基因同时又携带XRCC1 399 Arg/Arg基因型患者的化疗有效率明显高于同时携带194 Arg/Arg和399 Arg/Gln基因型患者。本研究结果表明，携带XRCC1 194 Trp突变基因的患者对铂类药物化疗敏感，同时携带XRCC1 194 Trp突变基因和399 Arg/Arg野生型基因的患者对铂类药物化疗更敏感，而携带XRCC1 194 Arg/Arg野生型基因和399 Gln突变基因的患者对铂类药物化疗耐药。

许多研究报告了XRCC3 241 SNP与肺癌易感性的关联，但其研究结果却不尽相同，就目前的研究结果而言，尚无证据表明XRCC3 241多态性与中国人肺癌易感性相关[16,17]。而XRCC3 Thr241 Met的SNP与铂类药物化疗敏感性关系的研究较少，国内仅见任胜祥等[18]报告了ERCC1和XRCC3 241基因多态性在接受含铂方案化疗NSCLC中的疗效预测作用，其结果显示，130例晚期NSCLC患者中85.4%携带XRCC3 241 Thr/Thr基因型，16.4%携带Thr/Met或Met/Met基因型。XRCC3 241各基因型之间化疗有效率无统计学差异。本研究结果显示，在130例晚期NSCLC患者中，携带Thr/Thr和Thr/Met基因型患者分别为87.7%和12.3%，未检测到Met/Met纯合突变基因型。携带XRCC3 241 Thr/Thr和Thr/Met基因型者之间的化疗有效率无统计学差异。但XRCC1和XRCC3多态在化疗敏感性方面却存在明显的交互作用。

综上所述，本研究发现，XRCC1 194和399基因单核苷酸多态性均与晚期NSCLC患者铂类药物化疗敏感性密切相关，而XRCC3 241单核苷酸多态性与铂类药物化疗疗效无关。不仅XRCC1 194和399两个位点的基因多态具有联合作用，而且XRCC1与XRCC3两个基因多态在铂类药物化疗敏感性方面亦存在明显的交互作用。由此可见，XRCC1和XRCC3两个基因的多态性可能对临床化疗药物的选择具有指导意义。但由于本研究样本量较少，在应用于临床之前尚需扩大样本深入研究DNA碱基切除修复系统乃至整个DNA修复系统与铂类药物敏感性的关系，为肿瘤个体化治疗提供理论依据。