uPA、ET-1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床相关性

蒋焱熠 刘一臻 史志周 王博石 商利 徐昕 张盛周 王明荣

肺癌是世界第一大恶性肿瘤,其发病率及死亡率居高不下,其中80%-85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),预后较差.尽管临床术式和治疗方案不断改进,但肺癌的复发和转移使中晚期NSCLC患者的5年生存率很低.寻找可预测NSCLC患者复发和转移的分子标志物,可能有助于提高临床诊断的精准率,便于提前干预,降低该病的复发和转移.

肿瘤细胞通过血管等发生移位是癌症发生及转移的一个重要途径.尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator, uPA)是一种重要的蛋白水解酶,可以把纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶.uPA通过降解细胞外基质,促使细胞移动.文献[1-3]报道uPA蛋白在乳腺癌、宫颈癌和直肠癌等人类恶性肿瘤组织中表达上调.体外研究[4,5]表明uPA在促进肿瘤侵袭转移中起重要作用.

内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一种强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原,ET-1通过自分泌和旁分泌调节作用,促进细胞增殖、浸润以及血管的生成.ET-1蛋白水平在部分恶性肿瘤中是升高的,如膀胱癌[6]、结直肠癌[7]、前列腺癌[8]以及NSCLC[9].卵巢癌的研究[10]显示ET-1能加快卵巢癌细胞的运动能力,增强肿瘤的侵袭性和转移.Boldrini等[11]报道具有高水平ET-1 mRNA的肺癌组织同时表现ET-1蛋白高表达.

本文通过组织微阵列联合免疫组织化学染色技术(tissue microarrays and immunohistochemistry, TMA-IHC)检测了155例非小细胞肺癌组织标本中的uPA和ET-1蛋白表达,进而分析了与临床、病理参数的相关性,以探讨其临床意义.

1 材料与方法

1.1 材料 共收集2006年7月-2009年7月中国医学科学院肿瘤医院胸外科肺癌手术标本155例.全部病例均由病理科诊断为NSCLC.其中,鳞癌73例,腺癌82例;男性110例,女性45例;年龄32岁-80岁,中位年龄60岁;肿瘤分期T2、T3、T4期分别为68例、53例和34例,有、无淋巴结转移各为112例和43例.其中有完整随访资料的病例为107例,死亡病例61例,平均随访时间为20个月(2个月-44个月).

1.2 试剂 兔抗人uPA抗体(001098-R/R1,稀释浓度1:200)、兔抗人ET-1抗体(000202-R/R1,稀释浓度1:200)购于赛驰公司,PV-9000免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司.

1.3 组织芯片制作 常规制作标本蜡块、切片.HE染色后经病理学专家复诊、定位标记.根据定位结果对石蜡块进行打点,每个病例用穿刺针取三个标记好的癌组织点,转移到芯片蜡块的相对应位置,对其进行切片.

1.4 免疫组化实验步骤 组织芯片常规脱蜡水化后,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶15 min,0.1%枸橼酸钠缓冲液中微波修复20 min,滴加一抗,4oC冰箱过夜,第二天依次加入试剂1和试剂2,在37oC下分别孵育20 min和30 min.DAB染色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检.

1.5 结果判定 以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性信号,以阳性肿瘤细胞百分率和染色强度两方面分别进行半定量评分.染色强度评价方法:不着色为0分,浅棕黄色为1分,中度着色为2分,深棕黄色为3分.阳性肿瘤细胞百分率评价方法:无阳性细胞为0分,阳性肿瘤细胞数1%-33%为1分,阳性肿瘤细胞数34%-67%为2分,阳性肿瘤细胞数达到67%-100%为3分.染色强度和阳性细胞百分率得分相加记为综合分,0分-2分为阴性/弱阳性,3分-5分为中度阳性,6分为强阳性.

1.6 统计学分析 使用SPSS 15.0软件进行数据统计,采用双侧卡方检验方法分析蛋白表达改变与临床病理参数的相关性,Kaplan-Meier方法分析蛋白表达与患者术后生存之间的关系.P<0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 uPA和ET-1在NSCLC组织中的表达情况 uPA阴性/弱阳性、中度阳性和强阳性表达在鳞癌中的比例各为12.3%、64.4%和23.3%,在腺癌中分别为12.2%、53.7%、34.1%,在全部病例分别为12.3%、58.7%、29.0%.ET-1在鳞癌中阴性/弱阳性、中度阳性和强阳性表达分别为2.7%、42.5%、54.8%,在腺癌中各为11.0%、30.5%、58.5%,在全部病例分别为7.1%、36.1%、56.8%(表1,图1,图2).

2.2 uPA和ET-1表达与NSCLC患者临床病理参数的相关性对uPA、ET-1表达与肿瘤组织的分期、区域淋巴结转移及分化程度进行相关性分析,结果显示单个蛋白在鳞癌的表达与以上临床病理参数均无关.uPA和ET-1同时高表达(强阳性)多见于无淋巴结转移的腺癌中(P=0.017)(表2).

2.3 uPA和ET-1蛋白表达与NSCLC患者术后生存时间的关系 经Kaplan-Meier分析,ET-1表达与NSCLC患者术后生存时间无关,uPA蛋白高表达或与ET-1同时高表达的腺癌患者具有较长的术后生存时间(P=0.007, P=0.016)(图3,图4).

表 1 155例NSCLC组织uPA和ET-1表达的免疫组化检测结果Tab 1 The expression of uPA, ET-1 protein in 155 cases of NSCLC by immunohistochemistry

图 1 uPA在NSCLC中表达的免疫组化染色Fig 1 The expression of uPA in NSCLC with immunohistochemistry.Left to right: negative/weak, moderate and high expression; A-F:squamous cell carcinoma; G-L: adenocarcinoma.

图 2 ET-1在NSCLC中表达的免疫组化染色Fig 2 The expression of ET-1 in NSCLC with immunohistochemistry.Left to right: negative/weak, moderate and high expression; A-F:squamous cell carcinoma; G-L: adenocarcinoma.

3 讨论

恶性肿瘤由于其细胞生长、增殖失控等多因素、多层面的不确定因素,导致目前在临床上还没有一个很好的治疗办法.肺癌是威胁人类健康最主要的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均居于癌症榜首.依靠传统的肺癌患者预后指标尚难把不同发病机制的患者区分开来.从分子水平寻找一些敏感性、特异性高的NSCLC相关分子标志物,可能为现有的预后指标提供重要补充.

uPA于1976年被Astedt等[12]在卵巢肿瘤细胞中发现.uPA以无活性的单链丝氨酸酶原形式由肿瘤细胞或其它细胞分泌,在细胞表面与uPAR(uPA的受体)结合后可被细胞表面的纤溶酶、舒血管素等激活.促进肿瘤细胞向受破坏的细胞外基质移动,引起肿瘤局部浸润性生长并进入脉管系统,进而发生远处转移[13].本研究发现NSCLC组织中存在uPA蛋白高表达,与国内外在其它肿瘤中观察的uPA变化相符.Yang等[14]在结直肠癌研究中发现uPA蛋白升高与淋巴结转移无相关性(P>0.05),也与本实验研究结果类似.Konecny等[15]报道uPA蛋白升高与卵巢癌患者较短的生存时间相关,而且可能作为一个独立的预后分子标志物.而本研究结果显示uPA蛋白高表达的肺腺癌患者却具有较长的生存时间,是否uPA在不同癌症中的作用有所差异,值得进一步研究.

表 2 uPA和ET-1在腺癌中高表达与临床病理参数的关系Tab 2 The relationship between uPA, ET-1 protein high xepression and clinicopathological parameters of adenocarcinoma

图3 uPA、ET-1表达与腺癌患者术后生存时间相关性的Kaplan-Meier分析Fig 3 The Kaplan-Meier survival curves of adenocarcinoma patients with expressions of uPA and ET-1. A: uPA expression (P=0.007);B: Expression of both uPA and ET-1 (P=0.016).

内皮素(ET)家族中有三种异构体:ET-1、ET-2和ET-3,三者之间仅有2个-6个氨基酸不同,具有组织特异性[16].人的ET-1基因全长12,464 bp,含有5个外显子.ET-1是体内最强的缩血管活性肽,广泛存在于血管内皮细胞及神经细胞内,在很多肿瘤中都有过度表达.在肿瘤发生发展的过程中,血管生成是一个较早期事件.本研究发现ET-1蛋白在NSCLC组织中表达上调,与文献报道一致.刘玉春等[9]采用免疫组织化学方法检测发现,ET-1在NSCLC组织中的表达高于肺良性病变组织,尤其是在具有淋巴结转移阳性的肺癌组织中.我们并没有观察到ET-1与NSCLC的任何临床、病理参数存在相关性.但是,本研究的结果显示uPA和ET-1同时高表达多见于无淋巴结转移的腺癌中,而且uPA和ET-1同时高表达的腺癌患者具有较长的术后生存时间.这一结果也反映了肿瘤发生发展中的多基因异常,uPA和ET-1蛋白的联合检测可能有助于肺腺癌的预后判断.