高分辨熔解曲线法检测非小细胞肺癌p53基因的突变

陈志红 安社娟 谢至 严红虹 陈剑光 苏健 张绪超 牛飞玉 郭伟浜 吴一龙

p53基因是迄今为止发现的与人类多种肿瘤相关性最高的基因。野生型p53基因是一个肿瘤抑制基因，而其突变型则具有致癌作用，p53基因突变广泛分布外显子5-8，可达95%-98%[1,2]。但p53的突变热点较多，比较分散，目前通常采用组织DNA直接测序法检测p53基因突变，费时且昂贵，无法满足临床需要。本研究旨在建立高分辨熔解曲线（high resolution melting, HRM）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者p53基因突变的方法[3,4]，探讨p53基因突变的特点及其在NSCLC发生发展中的演变规律。

1 材料与方法

1.1 标本来源 病例组为2007年-2009年广东省人民医院的NSCLC患者肿瘤标本，共264例，均为汉族，男184例，女80例，年龄23岁-88岁，均经病理学诊断确诊，且在知情同意后签署了知情同意书。对照组为肺癌患者的癌旁组织标本，共54例，均为汉族，男38例，女16例，年龄28岁-62岁。

1.2 主要试剂与仪器 HRM分析必需试剂：LightCycler 480 High Resolution Melting Master（瑞士Roche公司）；其它试剂和仪器：DNA 抽提试剂盒（上海华舜公司）、pGEM-T（美国Promega公司）、Gel Extraction Kit（德国Qiagen公司）、BIGDYE （美国Applied Biosystems公司）、核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）、PCR扩增仪（美国BD公司）、LightCycler 480荧光定量分析仪（瑞士Roche公司）、ABI3100测序仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集和DNA提取 组织在手术切除后快速冻存于液氮中，-80oC保存待用。将冰冻切片评估肿瘤组织含量＞50%的标本用于检测。组织样本（50 mg）中的DNA提取按照基因组DNA 抽提试剂盒说明书操作。使用Eppendorf核酸蛋白测定仪测定DNA纯度及含量，要求吸光度（A）值280/260＞1.80，调整DNA浓度至5 ng/μL。

1.3.2 HRM检测 按照文献[5]设计p53基因突变检测引物，外显子5-8的引物序列见表1。所有引物均由大连宝生物公司合成，用HPLC进行纯化。PCR体系包括10 ng的基因组DNA、1xPCR Master mix、3 mmol/L MgCl2、250 nmol/L的正反向引物，并用PCR级别的水补足至20 μL。所有的PCR均重复2次。PCR和HRM分析均在LightCycler 480荧光定量分析仪上进行。PCR条件：95oC 10 m，95oC 10 s，60oC 15 s，72oC 25 s，45个循环。HRM分析条件：95oC 1 min，40oC 1 min，熔解曲线数据收集从65oC到95oC温度上升率为1oC/s，且每升高1oC进行25次数据采集。

1.3.3 p53基因突变型和野生型（wild-type, wt）质粒的构建 采用TA克隆法分别构建p53基因外显子5-8的野生型克隆和突变型克隆，即分别以p53外显子5-8的测序结果为阳性的标本的DNA和测序结果为阴性的标本的DNA为模板进行PCR。PCR产物采用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化产物与pGEM-T载体连接，转化入大肠杆菌感受态细胞。37 °C过夜培养，筛选出重组体。将重组体加至细菌Luria-Bertani（LB）培养基，37 °C摇床孵育过夜，提取质粒、测序，验证转入序列的准确性。序列正确的质粒-20 °C保存待用。

1.3.4 HRM分析的灵敏性试验 野生型和突变型质粒的DNA浓度均调整至5 ng/μL，然后按不同比例将二者混合，使得样本中突变型质粒所占的比例分别为2%、5%、10%、20%、50%、100%，各取1 μL混合质粒DNA作为模板用于HRM检测。

1.3.5 直接测序法检测 HRM分析后，阳性标本采用测序引物进行PCR扩增，PCR产物按试剂盒操作说明书切胶过柱纯化，以纯化后的PCR产物为模板，在ABI3100测序仪上按测序试剂盒按照说明书进行测序检测。采用Chromas软件分析测序图谱，判读p53基因外显子5-8的突变类型。

表1 p53 HRM引物表Tab 1 p53 HRM primers

1.3.6 亚克隆测序 HRM法检测阳性而PCR产物直接测序法检测阴性的样品，进一步进行亚克隆测序证实。

1.4 统计学分析 SPSS 13.0统计软件分析数据，采用卡方检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HRM法的检测灵敏性 如图1所示，HRM法检测p53不同外显子不同比例的系列混合质粒DNA，2次结果的重复性好，且可检测出仅含2%-10%突变型DNA混合样本中的突变，提示HRM法检测p53基因突变的灵敏度可达2%-10%。

图1 HRM法检测p53基因外显子5-8的敏感性结果。野生型和突变型质粒混合后突变型所占的比例分别为2% 、5%、10%、20%、50%和100%，分别显示不同颜色的熔解曲线。A：外显子5：蓝（wt），绿（2%），红（5%），棕（10%），黄（20%），灰（50%），紫（100%）；B：外显子6：蓝（wt和2%），绿（5%），红（10%），紫（20%），黄（50%），灰（100%）；C：外显子7：蓝（wt，2%和5%），绿（10%），灰（20%），紫（50%），红（100%）；D：外显子8：红（wt），绿（2%），蓝（5%），黄（10%），紫（20%），灰（50%），棕（100%）。Fig 1 The exon 5-8 of p53 gene sensitive analysis by HRM. The mutation plasmid DNA was mixed with wild-type plasmid DNA to dilute the mutant allele to 2%, 5%, 10%, 20%, 50% and 100% of the total alleles. The melting curves of each dilution are shown in different color.A: exon 5: blue (wt), green (2%), red (5%), brown (10%), yellow (20%), grey (50%) and purple (100%);B: exon 6: blue (wt and 2%), green (5%), red(10%), purple (20%), yellow (50%) and grey (100%);C: exon 7: blue (wt, 2% and 5%), green (10%), grey (20%), purple (50%) and red (100%); D: exon 8:red (wt), green (2%), blue (5%), yellow (10%), purple (20%), grey (50%) and brown (100%).

2.2 HRM法和测序法检测结果 HRM法检测54例对照组的正常组织，未能检出p53基因突变。264例NSCLC患者的组织，检出具有p53基因突变104例，102例经测序法得到证实，突变率为39.4%，1例经亚克隆测序为野生型，1例DAN量不够无法进行亚克隆分析；95例为点突变，其中错义突变74例，无义突变6例，同义突变15例，其余7例为碱基插入和缺失导致的移码突变，突变中碱基转换突变占总突变的93.1%。各外显子不同突变类型的HRM曲线及测序结果见图2-图5。

2.3 p53外显子5-8的突变结果 p53外显子5、6、7、8的突变率分别为11.7%、8%、12.5%、10.6%，差异无统计学意义（P=0.35），且各外显子的突变率与吸烟、分化等临床参数均无关（P＞0.05）。

2.4 p53基因突变与临床病理特征的关系（表2） p53基因突变与性别有关，男性突变率（43.5%）明显高于女性（30%）（P=0.039）。p53基因突变与年龄、吸烟、病理、分期和分化等临床病理特征均无关（P＞0.05）。

图2 p53外显子5不同突变类型样品的HRM曲线和测序结果。A：HRM曲线图。蓝（野生型），灰（样品16），紫（样品172），黄（样品38），棕（样品211）；B：测序结果。Fig 2 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 5. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),grey (sample 16), purple (sample 172), yellow (sample 38) and brown(sample 211); B: Sequencing traces for sample16, 172, 38 and 211.

图3 p53外显子6不同突变类型样品的HRM曲线和测序结果。A: HRM曲线图。蓝（野生型），棕（样品60），黄（样品251），绿（样品199），红（样品97）；B：测序结果。Fig 3 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 6. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),brown (sample 60), yellow (sample 251), green (sample 199) and red(sample 97); B: Sequencing traces for sample 60, 251, 199 and 97.

图4 p53外显子7不同突变类型样品的HRM曲线和测序结果。A: HRM曲线图。蓝（野生型），绿（样品21），紫（样品127），灰（样品132），红（样品220）；B：测序结果。Fig 4 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 7. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),green (sample 21), purple (sample 127), grey (sample 132) and red(sample220); B: Sequencing traces for sample 21, 127, 132 and 220.

图5 p53外显子8不同突变类型样品的HRM曲线和测序结果。A: HRM曲线图。蓝（野生型），紫（样品48），灰（样品167），棕（样品154），绿（样品147），黄（样品67）；B：测序结果。Fig 5 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 8. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),purple (sample 48), grey (sample 167), brown (sample 154), green(sample 147) and yellow (sample 67); B: Sequencing traces for sample 48, 167, 154, 147 and 67.

表2 p53基因突变与临床病理特征的关系Tab 2 Correlation between p53 gene mutations and clinicopathologic features

3 讨论

抑癌基因p53的突变已被证实与人类半数以上的肿癌发生有关。该基因编码一种分子量为53 kDa的蛋白质，命名为p53。一旦p53基因发生突变，p53蛋白失活，细胞分裂失去节制发生癌变。目前对p53基因变异与肿癌生物学行为关系的研究发现，在肺癌、胃癌、乳腺癌及大肠癌中，具有p53突变患者的恶性程度较高、预后较差[2,6,7]。本研究采用HRM结合DNA序列分析法在39.4%的NSCLC癌组织中检出p53突变，且突变与临床分期和分化程度均无关系，提示p53基因突变可能于肺癌早期就发生，并持续于肿瘤发展的全过程，有助于判断NSCLC患者的预后。p53基因有多种突变类型，主要为点突变，导致碱基转换，发生错义突变，本研究结果与Lee等[8]的报道一致。Suzuki等[9]报道p53基因突变与吸烟有相关性，本研究结果显示p53基因突变虽然在吸烟者中较多见，但吸烟与非吸烟患者间无统计学意义。p53基因突变在男性中的发生率明显高于女性，这与Lee等[8]报道非吸烟女性中p53基因突变的发生率较低相一致。 p53基因突变的突变特点和分布等均无统计学意义，提示p53基因突变是自发性突变，可能是在DNA合成和修复过程中的随机错误所致。

本研究共发现7例p53基因由于碱基插入和缺失导致的移码突变，HRM法和测序法均可确定。其测序图谱部分为单一峰，从突变位置开始为重叠峰。为确定是含有杂合突变还是由于PCR错配而导致的重叠峰，可采用高保真酶重复进行PCR和测序，如出现重叠峰的位置均一致，可判断为杂合突变，因为PCR错配的发生点不是唯一的，每次均发生在同一点的几率较少，或者进行克隆性测序。

目前检测基因突变的方法有很多，最常用的有直接测序法、荧光探针法、单链构象多态（single-strand conformation polymorphism, SSCP）法、变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）等，各种方法均有不同的优缺点。直接测序法由于能直接鉴别出具体突变的碱基，所以一直都被作为检测突变的金标准。但这种方法步骤繁琐，耗时长，费用高，敏感性相对低，难以达到临床上的需要。本研究使用的HRM法是近几年来在国内外兴起的最新的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）及突变研究的工具。它是通过熔解温度（Tm）的迁移而产生不同形状的熔解曲线来区分不同的基因型。这种方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需根据不同的序列设计特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，就可完成对样品基因型的分析。HRM法所使用的PCR扩增酶必须是热启动酶，减少非特异性扩增，使用的染料必须是饱和染料，才能根据熔解曲线的不同来区分不同的基因型。应用HRM法筛选NSCLC肿瘤标本的p53基因突变样品，具有操作简便、快速、敏感、单管避免污染等优点，完全符合临床个体化治疗的要求，值得推广。