复合诱变在提高毛霉抗菌活性中的应用研究

2011-09-04赵昌会罗静瑶

湖南农业科学 2011年22期

赵昌会，罗静瑶

（1.湖南科技学院生化系，湖南永州 425100；2.海南大学农学院，海南海口 570228）

总状毛霉（Mucor racemosus）在腐乳的酿造过程中，不仅对腐乳独特风味的形成有关键作用，而且其产生的多种酶类，如活性蛋白酶中的抗菌肽、细菌素、溶菌酶等都具有抗菌及抑菌功能，从而使腐乳能保存较长时间。毛霉菌种的优劣直接影响到腐乳的产量和质量。优良的生产菌种往往在使用过程中会出现性状退化现象，从而导致产品的质量下降，严重时甚至不能正常生产。因此，对生产菌种进行诱变处理，筛选出抑菌能力强、生长速度快、孢子数量多的菌株是十分必要的。为此，笔者通过紫外线-氯化锂及亚硝酸钠复合诱变，以期筛选出高抑菌活性的毛霉菌株。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验菌株：毛霉M1（分离于广合腐乳）；指示菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及蜡样芽孢杆菌（湖南科技学院微生物实验室）；马铃薯和豆腐（市售）。

1.2 培养基

PDA培养基；PSA培养基；诱变培养基（参考吴红艳并加以改进）：PSA培养基加入3 g K2HPO4，1.5 g MgSO4•7H2O， 1.5 g LiCl，pH自然；生物测定培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 孢子悬液的制备从广合腐乳中分离出毛霉M1，并通过纯化培养出其成熟孢子。用生理盐水将毛霉M1的成熟孢子制成孢子悬液，倒入灭菌的150 mL三角瓶中，振荡25～30分钟，使孢子分散和活化，过滤，制备成孢子数约107个/mL的单孢子悬液。

1.3.2 紫外线-氯化锂复合诱变开紫外灯（15W）预热30分钟，使光波稳定；取10 mL孢子悬液于无菌的培养皿中，置于离紫外灯30 cm的磁力搅拌器上；打开搅拌器，使孢子液分别在紫外灯下照射0（对照）、1、2、3、4、5、6、7、8分钟；照射后在暗光条件下，取1 mL的诱变菌悬液加入到无菌试管中冰浴1小时，以抑制突变株中的修复酶活性，从而提高诱变率；将冰浴后的菌液0.5 mL涂布于诱变培养基上；做3个平行，以未经诱变的菌液作为对照；25℃避光培养3天，计算相对致死率，挑选生长速度快、孢子数量多的菌株进行保藏。

1.3.3 亚硝酸钠诱变处理取0.2 mol/L亚硝酸钠溶液1 mL于大试管中，加入1 mL经紫外诱变处理的孢子悬液后，立即加入pH 4.5的醋酸缓冲液1 mL，充分混匀后27 ℃水浴，诱变不同时间后加0.07 mol/L pH 8.6的Na2HPO4溶液2 mL以终止反应。然后将孢子悬液稀释10倍，取1 mL涂布于PDA平板上，25 ℃培养3天，计算相对致死率，并挑取菌落较大的菌株分离纯化。

1.3.4 诱变菌株的抑菌能力将筛选的突变株接种到豆腐上发酵3天，在超净工作台上将腐乳捣碎，制备无菌浸出液，取200 μL，加到含指示菌生物测定平板的滤纸片（约6 mm）上，30 ℃培养3天，利用直尺测量抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 紫外线-氯化锂复合诱变的效果

孢子悬液经紫外照射不同时间后，取样稀释，涂布于诱变培养基上，以未诱变的孢子悬液作对照，培养3天，统计诱变致死率。结果显示，紫外线-氯化锂对毛霉的致死作用显著，120秒致死率接近80%，240秒几乎致死所有孢子（见图1）。因此，选取两株诱变时间为120秒、生长速度较快的菌株做进一步试验。

2.2 亚硝酸钠诱变的效果

将紫外线-氯化锂处理筛选的菌株培养于PDA平板上，25 ℃培养3天，分别制取孢子悬液，经亚硝酸钠处理，取10倍稀释的孢子悬液1 mL涂布于PDA平板上，25 ℃培养3天，计算结果如图2：经亚硝酸盐处理8～12分钟，致死率在70%～80%。因此，从诱变8分钟和12分钟的平板上挑取菌落较大的菌株，经纯化得到菌株A和B。与出发菌株相比，菌株A和B的菌丝较短，孢子颜色较深，A的菌丝呈白色，出发菌株和菌株B的菌丝呈浅黄色。

2.3 诱变菌株的发酵

将菌株A和B及出发菌株分别接种于PSA培养基上，培养3天后，取0.5 mL的菌悬液分别接种到新鲜豆腐（每块接种0.5 mL）上，25 ℃发酵3天。结果表明，诱变后的菌株接种的豆腐乳色泽偏黄，菌丝体不发达（图3）。

2.4 诱变菌株的抑菌能力

出发菌株经两次诱变后，接种于新鲜豆腐上，培养3天后，A和B菌株的菌丝均较少，颜色为淡黄色或金黄色；抑菌活性较高，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及状芽孢杆菌的平均抑菌直径分别为18、14及13.5 mm，比出发菌株M1的抑菌直径分别大80%、55.5%及50%；对A和B菌株进行传代，均表现出良好的遗传稳定性。