基于DNA条形码的广西苦瓜中实蝇幼虫分子鉴定研究*

姜 帆, 刘佳琪, 李志红**, 吴佳教, 赵 朔

(1.中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100193; 2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广州 510623)

基于DNA条形码的广西苦瓜中实蝇幼虫分子鉴定研究*

姜 帆1, 刘佳琪1, 李志红1**, 吴佳教2, 赵 朔1

(1.中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100193; 2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广州 510623)

实蝇是多种热带、亚热带水果和蔬菜的重要害虫,其卵、幼虫、蛹难以通过形态特征进行种类鉴定。DNA条形码是近年来出现的物种分子鉴定技术,能够实现对昆虫非成熟虫态的快速鉴定。本研究利用DNA条形码技术和BOLD系统,选取线粒体DNA细胞色素氧化酶I(COI)基因片段,针对采自于广西南宁地区苦瓜中的实蝇幼虫样品进行了序列测定、比对和分析。结果显示,在所检测的10头实蝇幼虫样品中,有4头为瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]、6头为南亚果实蝇[Bactrocera tau(Walker)]。

实蝇; 幼虫; DNA条形码;COI基因; 分子鉴定

*致 谢: 感谢广西出入境检验检疫局李伟丰、李树庆、龚秀泽等在样品采集过程中给予的大力支持。

**通信作者 Tel:010-62733000;E-mail:lizh@cau.edu.cn第1作者与第2作者对本文为同等贡献

实蝇是重要的果蔬害虫之一,也是国际上重要的检疫性害虫,近年来口岸截获的实蝇数量和批次有大幅上升的趋势[1]。广西地处亚热带,生态环境复杂,与相邻东盟国家的果蔬贸易频繁,给实蝇的传播提供了有利条件,控制实蝇蔓延已经是当地植检工作的重要课题。2000-2004年广西检验检疫局组织各口岸局开展了全区实蝇检测工作,4年多来共设监测点1 940个,连续采集了广西不同地区、不同季节和不同寄主环境下的实蝇25万头。经鉴定,共有橘小实蝇等26种,其中橘小实蝇、瓜实蝇、南亚果实蝇3个种是广西的优势种,发生普遍,数量也较多,基本分布于全区各地[2]。

传统的物种鉴定工作主要依靠形态学特征,但由于区分不同实蝇种类之间的形态学差别往往非常细微和复杂,仅有少数专家能够对关系紧密、亲缘较近的实蝇种类进行准确的区分。同时,由于口岸截获的实蝇很多情况下并非成虫,不表现种水平的区分特征,只有等培养成熟后才能被准确鉴定[3],极大地降低了检疫工作的时效性。

近年来,随着DNA检测和分析技术的快速发展,各种分子生物学手段被广泛应用于实蝇的种类鉴定,如RFLP、AFLP以及DNA测序等[4],而通过测定某个或某几个基因的部分序列来进行种类鉴定和区分的DNA条形码(DNA barcode)技术也得到了迅速的发展和使用[5]。这一技术可以让非专业人员在很短时间内准确、经济地对目标物种进行鉴定[6]。线粒体DNA上的细胞色素氧化酶I(COI)基因的100～650 bp被证实能对很多动物物种进行高效区分[7],是进行DNA条形码分子鉴定的首选目的基因。

BOLD(the barcode of life data)系统是为DNA条形码的获得、储存、分析及发表提供帮助的信息平台(http:∥www.boldsystems.org/views/login.php)。通过整合生物分子、形态、区域分布的数据,该系统在各类生物信息之间建立了联系。用户通过BOLD可以在全球基因序列数据库中免费获得DNA条形码序列[8]。BOLD系统目前记录了动物界、植物界、真菌界、原生生物界共118 204种生物的DNA条形码,其中记录的517种实蝇科昆虫中,Dacinae亚科、Tephritinae亚科和Trypetinae分别占197、195种和113种,在Dacinae亚科中,Bactrocera、Ceratitis和Dacus为记录较多的3个属,分别为 83、34、50种。

本研究应用 DNA条形码分子鉴定技术,对2009年采自于广西南宁地区苦瓜果实中的实蝇幼虫样品进行了mtDNACOI基因片段的序列检测,与BOLD系统中的标准序列进行了比对和系统发生分析,并得到了分子鉴定结果。

1 材料与方法

1.1 样品

本研究所用实蝇试材采自于广西壮族自治区南宁地区一苦瓜菜园的多个苦瓜果实,通过剖果采集。实蝇幼虫样品共计10头,采集后液浸于100%的乙醇中并低温保存。

1.2 成虫诱集

本研究采用广东出入境检验检疫局提供的诱捕器和诱饵对上述地区的实蝇成虫进行监测。Steiner式诱器中添加橘小实蝇引诱剂(Me)或瓜实蝇引诱剂(Cue),每个诱捕器为一种引诱剂;Mcphail式诱器中加蛋白诱饵。

1.3 DNA提取

依据李云龙[9]方法,采用天根生化科技(北京)有限公司的“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”,进行实蝇幼虫总DNA的提取。

1.4 PCR扩增及序列测定

扩增的目的片段是mtDNA中COI基因总长度为615 bp的一段序列,扩增引物参考Folmer所使用的LCO-1490和HCO-2198[10],由北京奥科生物科技有限公司合成,信息如表1所示。

表1 引物序列信息

PCR 反应的总体积为52 μ L,具体包含:6.0 μ L 10 ×buffer缓冲液,3.0 μ L MgCl2,2.0 μ L dNTPS,0.4 μ LTaqDNA 聚合酶 ,上下游引物各 3.0 μ L,ddH2O 32.6μ L,DNA 模板 2.0 μ L。反应条件为94℃加热3 min,然后进行39次PCR循环:94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min,PCR产物保存于4℃。2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,EB染色检测。

委托北京奥科生物技术公司进行纯化并进行双向测序,测序均在ABI-3730测序仪上进行。

1.5 序列比对和分析

双向序列返回后,由DNAMAN软件对每一样品正反向测序的结果拼接,得到单条准确序列。然后在BOLD(barcode of life date systems v2.5)数据库中的identify specimen功能进行相似性比对,以确定所扩增的615 bp序列的种群,然后查看鉴定结果(identification summary)以及相似性数据(distance summary),最后利用PAUP 4.0软件采用最大似然法(ML)、邻接法(NJ)和简约法(MP)构建所检测的10个实蝇样品与BOLD、GenBank数据库中相关种实蝇的系统发育树,以核实确定鉴定的结果。

2 结果

2.1 成虫诱集结果

所诱集到的成虫全部为瓜实蝇和南亚果实蝇。

2.2 PCR扩增结果

PCR产物经凝胶电泳检测后含有615 bp特异片段的PCR粗产物,结果如图1所示,其中第1泳道为Marker,第11泳道为阴性对照。

图1 实蝇幼虫COI基因扩增结果

2.3 序列测定结果

经过正反向拼接、同物种序列比对和手工校正,最终得到了长度为615 bp的高质量COI序列10条。

2.4 相似性比对鉴定结果

经BOLD的分子鉴定结果为:瓜实蝇有4头,对应上述PCR扩增结果的第4、5、7、8泳道,与 BOLD中 瓜 实 蝇 GBDP1754-06、GBDP2095-06、GBDP2100-06、GBDP2095-06比对的相似性分别为100%、100%、99.84%、100%;南亚果实蝇为 6头,对应上述PCR 扩增结果的第2、3、6、9、10、12泳道,与BOLD中南亚果实蝇MVTBI310-09的相似性分别为 100%、100%、100%、99.66%、99.83%、100%。

图2 ML法构建的未知种及其相关种系统发育树

将相似度非100%的第7、第 9、第10泳道的序列提交GenBank,获得注册号分别为:HM590447、HM590448、HM590449。

2.5 系统发育树

利用PAUP 4.0软件,分别采用最大似然法、邻接法和简约法构建各条序列与BOLD、GenBank数据库序列之间的系统发育树,分属各物种的个体的聚集趋势十分显著,这表明同一物种的个体可以和其他物种的个体很好地区分开,而结果也验证了前面分子鉴定的结论。

2.6 结论

通过分子鉴定以及系统发育树的确认,从苦瓜果实中提取的10头实蝇幼虫为南亚果实蝇和瓜实蝇共存,其中南亚果实蝇6头,瓜实蝇4头。所鉴定的实蝇幼虫种类与本试验的成虫诱捕结果相吻合,同时也与当地的实蝇优势种群及寄主一致[2,11]。

3 讨论

通过进行线粒体DNA上COI基因615 bp序列的测定和比较分析,广西南宁苦瓜园苦瓜果实中采集的实蝇幼虫得到了成功的鉴定和区分。因此本研究得到的序列完全可以作为DNA Barcode序列补充进入BOLD系统,同时本研究在今后也完全可以应用于一线口岸的实际检疫工作中,这种方法的推广在保证物种鉴定准确性的同时,将大大降低非成虫态对象在实际工作中的检疫难度,提高通关效率。同时,本研究也进一步验证了基于COI基因的可变位点特征,615 bp甚至更短的片段序列即可以对物种达到区分效果[12],从而实现有关物种的快速、准确鉴定。

在使用BOLD系统的序列构建系统发育树的时候,我们也发现有时会出现部分物种和系统发育结果不一样的位置。这说明barcode并不能代替传统的系统发育分析,利用BOLD系统构建的系统发育树可以作为分子鉴定的补充,但并不能直接视为相应物种在进化上的系统发生关系,这和之前的很多研究结果是一致的[13]。

各种DNA分子标记已经被广泛应用于亲子鉴定和个体识别领域[14],在实蝇分子鉴定领域也有了许多应用和进展[15]。本研究的思路在今后的检疫工作中同样具有重要的开发价值,相信随着中文实蝇条形码数据系统的进一步研究以及有关物种线粒体DNACOI基因序列的进一步积累,最终将帮助我们实现实蝇种群更加快速、准确、经济的分子鉴定。

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[9]李云龙.基于线粒体COI和ND6基因的橘小实蝇种群遗传关系研究[D].北京:中国农业大学农学与生物技术学院,2009.

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Molecular identification of fruit fly larvae by DNA barcodes

Jiang Fan1, Liu Jiaqi1, Li Zhihong1, Wu Jiajiao2, Zhao Shuo1
(1.College of Agronomy and Biotechnology,China Agricultural University,Beijing100193,China;2.Inspection and Quarantine Technology Center,GuangdongEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510623,China)

Fruit fly(Diptera:Tephritidae)is an important pest of a variety of tropical and subtropical fruits and vegetables,while species identification at its egg,larvae and adult stages is difficult by morphological characteristics.Emerging as a promising molecular technology of species identification,DNA barcodes can realize rapid identification of the immatures.Based on the DNA barcoding and BOLD system,a series of studies,including sequencing,alignment and analysis,were conducted based on the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I(COI)gene using fruit fly larvae samples collected from balsam pear in Guangxi.The results showed that four of the ten larval specimens wereBactrocera cucurbitae(Coquillett),and six of them areBactrocera tau(Walker).

fruit fly; larva; DNA barcode;COIgene; molecular identification

S 436.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.033

2010-05-25

2010-06-31

农业部“引进国际先进农业科学技术”项目(2009-Z41);国家公益性行业(农业)专项(200903034);国家自然科学基金(30771432)