脂蛋白脂酶基因和对氧磷酶1基因联合作用与脑梗死发病的相关性

杨玉梅， 吴 江， 杜丹华， 高 鹏， 刘进香

流行病学及病因学研究表明脑梗死是一种性状复杂的多基因遗传病，其发病过程中存在基因-基因和基因-环境的相互作用［1］。动脉粥样硬化(AS)是脑梗死的主要病因，与脂代谢障碍有关。本研究选取脂代谢环路上的脂蛋白脂酶、对氧磷酶1基因为候选基因，在这2个基因上选择5个SNPs位点为遗传标记，应用病例-对照的关联分析方法，探讨这两个基因间相互作用与脑梗死发病的相关性。为脑梗死的早期预警和针对基因功能的个体化治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择中国北方汉族脑梗死患者和排除脑梗死的健康人为研究对象。其中病例组705人，为2005年10月～2006年6月在吉林大学白求恩第一医院神经内科住院的脑梗死患者，平均年龄60.9±10.9岁。所有患者均符合1995年中华医学会第四届脑血管病会议修订的各类脑血管疾病诊断要点，由两名神经科医生根据详细的神经科检查、头部CT和/或MRI扫描确诊为脑梗死，并除外潜在的心源性栓子和周围血管栓塞性疾病者、大动脉炎、外伤、血液病、药物、恶性肿瘤、血管畸形或动脉瘤等引起的脑梗死。按TOAST分型标准［2］，分为动脉粥样硬化性脑梗死组(AS)和腔隙性脑梗死(IS)组。对照组410例，来自吉林大学第一医院体检中心同期健康体检人群，与病例组的年龄、性别相匹配。所有研究对象均有完整的临床资料，包括性别、年龄、体重指数、既往史、吸烟、饮酒史、家族史、血生化指标(血糖、血脂)、头部CT或MRI检查结果，部分患者行脑彩超和颈部血管彩超检查。所有入组病例均签属知情同意书。

1.2 引物设计 根据人类单倍体图计划［3］(Hapmap)提供的汉族人数据，选取LPL基因上的2个SNP(SNP1:rs328及SNP2:rs326)及PON1基因上的 3个标签 SNP(tagSNP)(SNP3:rs2299262、SNP4:rs854552、SNP5:rs662)为遗传标记，根据引物设计原则设计引物。引物序列如下:SNP1:F:5’-TCACATCCATTTTCTTC，R:5’-CACAGTACAGCTTTAGCACAGAATGCTCACCAGACT-3’;SNP2:F5’-AGGCAGATGCCC TAA TTC C-3’，R:5’-CAC CCT GTG GAA GAA AAT GG-3’;SNP3:F:5’ATCCTCAAACACCTCCGTGA-3’，R:5’-AGGCCCAGAACATTTGGACT-3’;SNP4:F:5’-TGGAGTTCTAAAGACACGTGAGC-3’，R:5’-GGGAGTGATATGATGTGTAGGG-3’;SNP5:F:5’-GCACTTTTATGGCACAAATCATCAC-3’，R:5’-TCCATTAGCAAAATCAAAGCC-3’。

1.3 人外周血白细胞基因组DNA的提取 所有研究对象均于清晨空腹经肘前静脉取血2ml，肝素抗凝。取300μl用Promega基因组快速提取试剂盒提取基因组DNA。

1.4 基因型检测 用PCR-RFLP方法进行基因型检测。(1)PCR反应体系为23μl，其中双蒸水14.2μl，0.92mmol Tris-HCl(pH8.3)，46mmol KCl，1.5mmol MgCl，4 种 dNTP 各 200μmol，引物各1.5 μmol，Taq DNA 聚合酶 1.0U(Promega，北京)，基因组DNA30～50ng。(2)SNP1位点PCR扩增产物行HinfⅠ内切酶消化;SNP2位点PCR扩增产物行MspⅠ内切酶消化;SNP3位点PCR扩增产物行ECORⅠ内切酶消化;SNP4位点PCR扩增产物行BstN1内切酶消化;SNP5位点PCR扩增产物行DpnⅡ内切酶消化。酶切产物用 2.5%琼脂糖凝胶电泳(90mmV)50min，在凝胶成像系统(UVP，美国)下观察结果。

1.5 统计学分析 应用拟和优度检验分析病例组和对照组基因型频率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡;UNPHASED遗传学软件应用cocaphase对等位基因频率进行分析;SPSS15.0软件包应用卡方检验对基因型频率进行分析。P＜0.05认为差异有显著性。应用等位基因条件分析(conditioning on allele，COA)的方法分析基因的联合作用与脑梗死的关系。

2 结果

2.1 临床资料分析 脑梗死组与对照组间性别、年龄、BMI无明显差异。动脉粥样硬化性脑梗死组收缩压、舒张压、血糖、甘油三酯与对照组相比差异有显著性。腔隙性脑梗死组收缩压、舒张压、血糖与对照组相比差异有显著性。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析结果 对研究对象的各SNP位点进行拟和优度检验，脑梗死组和对照组基因型分布均未偏离H-W平衡。

2.3 基因型及等位基因频率比较 脑梗死组与对照组相比各位点基因型频率差异无显著性，将脑梗死组按TOAST分型标准分为动脉粥样硬化性脑梗死组和腔隙性脑梗死组进行亚组分析，仍无显著性差异(见表1)。SNP1(rs328)G等位基因频率在动脉粥样硬化性脑梗死组与对照组相比差异显著(χ2=4.83，P=0.034，OR=1.47，95%CI=1.03 ～2.13);SNP2(rs326)G等位基因频率在动脉粥样硬化性脑梗死组与对照组相比差异显著(χ2=3.597，P=0.047，OR=1.64，95%CI=1.12 ～1.84)(见表2)。

2.4 LPL基因与PON1基因多态联合作用与脑梗死的相关性分析 应用等位基因条件分析(conditioning on allele，COA)的方法分析基因的联合作用与脑梗死的关系。在本研究中，以位于8p22上的阳性位点rs328为条件，来分析位于7q21上的rs2299262和rs854552与rs662等位基因的联合对脑梗死的发病是否具有作用。结果显示PON1基因上的rs2299262位点与LPL基因上的rs328联合作用与脑梗死的发病具有相关性(χ2=6.26，df=2，P=0.043)(见表3)。

表1 各组基因型分布(%)

表2 各组等位基因频率分布(%)

表3 SNPs联合作用的条件检验结果

3 讨论

遗传学研究表明脑梗死属于多基因遗传病。多基因性状或遗传病的形成，往往是多个微效基因累加作用的结果，即其中每种基因的作用相对较微弱，数个基因的迭加作用或基因间的相互作用导致了疾病的发生。脑梗死作为复杂性疾病，其发病过程中同样存在基因-基因和基因-环境的相互作用。已有研究报道基因与基因间的联合作用与脑梗死的发病存在关联［4～7］。基因间的相互作用主要表现为:(1)一个信息传导通路上的基因可参与激活或抑制另一条信息传导通路;(2)两种不同的信息传导通路可共同作用于同一基因调控区而协同发挥作用;(3)同一基因可作用于几条信息传导通路。

3.1 LPL基因多态性与脑梗死的相关性 由于LPL基因变异可能影响血脂水平和血管功能，从而影响个体对缺血性心、脑血管病的易感性，所以国内外很多学者都进行过LPL基因与脑血管病的相关性研究。我们的研究发现LPL基因rs328、rs326位点G等位基因分布在动脉粥样硬化性脑梗死组与对照组差异显著，推测它们可能与动脉粥样硬化性脑梗死的发病相关［8，9］。

3.2 PON1基因多态性与脑梗死的相关性对氧磷酶1(PON1)基因有多个多态性位点，其突变可造成相应酶活性的改变，在动脉粥样硬化的形成中起重要作用［10］，故推测其可能影响缺血性脑卒中的发生。我们的研究未发现PON1基因的4个多态性位点与脑梗死的发病相关［11］。

3.3 基因联合作用与脑梗死发病的相关性本研究所选的5个SNP位点位于两条不同的染色体上，我们应用等位基因条件分析的方法分析基因的联合作用与脑梗死的关系。该方法分析的优点是检验效力强，可研究不同染色体上的基因位点之间的联合作用，阐明相互作用的多个位点与脑梗死发病的关联性。本研究中以位于8p22上的阳性位点rs328为条件，来分析位于7q21上的rs2299262和rs854552与rs662等位基因的联合对脑梗死的发病是否具有作用。结果显示PON1基因上的rs2299262位点与LPL基因上的rs328联合作用与脑梗死的发病具有相关性(χ2=6.26，df=2，P=0.043)。我们考虑如下:(1)我们前面的研究已经发现rs328位点多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的发生相关［8］，推测该多态性促进动脉粥样硬化斑块的形成，斑块形成及继发的炎症反应过程中释放的细胞因子可能引起PON1基因表达的变化，影响了循环中PON1的活性，促进了脑梗死的发生;(2)PON1基因临近烯醇式丙酮酸脱氢酶激酶基因，说明PON1基因与糖代谢基因连锁。而rs328多态性可能与高血糖者发生脑梗死的风险相关，推测rs2299262位点与糖代谢基因的相互作用扩大了rs328多态性的效应。但上述假设尚需进一步验证。

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