辽宁地区汉族人群FOXP2基因单核苷酸多态性研究*

赵云静，孙洪伟，李书娟，麻宏伟

（1.中国医科大学附属盛京医院 发育儿科，辽宁 沈阳 110004；2.沈阳医学院奉天医院 儿科，辽宁 沈阳 110024；3.辽阳石油化纤公司职工医院 儿科，辽宁 辽阳 111003）

Forkhead box P2（FOXP2）基因位于 7q31，是2001年人类发现的第一个言语相关基因，FOXP2基因突变可以导致严重的语言和言语障碍[1-2]。FOXP2基因的编码产物FOXP2蛋白作为一种转录因子可以调控其它基因的表达[3]。FOXP2基因是有关语言及言语障碍性疾病的重要候选基因。但我国目前有关FOXP2基因的研究少见，因此该基因的多态性在我国人群中的分布规律及特点尚不清楚。基因多态性在不同种族间差异很大，了解基因的多态性有利于明确人类种族差异，并且可用于进行复杂性疾病的基因定位、疾病易感性研究。本研究选取FOXP2基因内 5个单核苷酸多态位点：rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031，对其等位基因及基因型频率在我国辽宁地区汉族人群中的分布情况进行了分析，为FOXP2基因相关疾病的研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所需主要试剂：平衡酚购自上海生工生物有限公司；蛋白酶K购自德国MERCK公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs购自Takara公司；限制性内切酶 ApalI、AflII、RsaI 及 VspI、Tru1I 分别购自美国NEB公司和MBI公司；DNA Marker DL-2000购自大连宝生物工程有限公司。引物由上海invitrogen公司合成。

1.2 仪器与设备

实验所需主要仪器设备包括TGL-16G台式高速离心机、TP600 型 PCR 扩增仪（Takara，Japan）、BG-Power600i电泳仪（BAYGENE公司）、HZS-H 恒温水浴振荡器、自动凝胶成像及分析系统、QIAQuick PCR purification kit及 ABI 3730 DNA测序仪。

1.3 试验方法

选择140名无血缘关系的辽宁地区健康体检儿童作为研究对象，年龄4.5～12岁，均为汉族，既往健康，无遗传性疾病及神经、精神疾病史。

1.3.1 基因组DNA提取 留取受试者外周静脉血2 mL，经EDTA抗凝，分离白细胞，按照常规酚-氯仿异戊醇法提取基因组DNA。

1.3.2 PCR扩增目的基因片段 采用PCR扩增目的基因片段，引物选自参考文献[4]或采用Primer Premier5.0软件设计，由invitrogen公司合成。 PCR反应总体积为20μL，包括10×缓冲液（2.5 mmol/L plus Mg+）1.25μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，10 pmol上游、下游引物各0.1～0.5μL，DNA模板1～2μL，1～2u Taq聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性3～4 min，94℃变性 30～40 s、55～61℃退火 40～60 s、72℃延伸 50～60 s、30～35 个循环，72℃延伸 7 min。PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶检测，若目的电泳带清晰、无杂带，表明PCR扩增成功。各引物序列详见表1。

表1 各SNPs位点及PCR扩增引物序列

1.3.3 PCR-RFLP分析及基因分型 PCR产物扩增成功后选用相应的限制性内切酶进行酶切分析，配制20μL酶切反应体系：PCR反应产物5μL，10×Buffer 2μL，内切酶 0.5～0.8μL，加 ddH2O 至20μL。放置于水浴箱中消化3 h。酶切消化结束后加入10×Loading buffer 2.0μL终止酶切反应。将酶切反应产物加至2%或2.5%的琼脂糖凝胶上样孔中，设定电压100 V，在1×TBE溶液中电泳40～60min。电泳结束后在凝胶自动成像系统中成像扫描，记录各样本SNPs的等位基因型。各SNPs位点限制性内切酶及酶切产物详见表2。

1.3.4 直接测序 根据酶切电泳图随机选取不同条带的样本进行PCR扩增，每个SNP位点共选取6个样本，PCR反应体系50μL，PCR反应条件同前，扩增成功后进行直接测序分析。PCR产物纯化应用QIAQuick PCR purification kit（Qiagen，Germany）进行，在 ABI 3730 DNA 测序仪（Perkin Elmer，Foster city，California，USA）进行测序。测序结果与酶切分析结果及GeneBank数据库中人类FOXP2基因NC_000007.12序列进行比较。

表2 各SNPs位点限制性内切酶及酶切产物

1.4 统计学分析

各多态位点的基因型和等位基因型采用百分率表示，根据Hardy-Weinberg平衡定律计算各多态位点基因型的期望值，采用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。组间等位基因频率的比较采用χ2检验，数据处理采用SPSS12.0软件包，P＜0.05为具有统计学意义。检验水准为α=0.05。各位点间的遗传相关性分析采用连锁不平衡检验，数据处理采用在线分析程序SHEsis online program[5]。

2 结果

2.1 辽宁地区汉族健康人群FOXP2基因SNP的Hardy-Weinberg定律吻合度检验

FOXP2基因内的 5个 SNPsrs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031 在辽宁地区汉族人群中均有多态性，其基因型及等位基因频率分布见表3，经Hardy-Weinberg吻合度检验 ，rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和rs1456031位点P＞0.05，表明本研究群体中各位点的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明样本具有群体代表性。实验中，有个别样本的FOXP2基因单核苷酸多态位点经多次PCR或酶切反应仍不成功，未能成功分型，其中包括rs2396722位点2例，rs1852469位点3例，rs1456031位点2例。见表3。

2.2 辽宁地区汉族健康人群与其他人种FOXP2基因SNPs比较

本研究将结果与其他种族人群的有关数据进行了比较，结果显示FOXP2基因5个多态位点等位基因分布与西班牙高加索人比较差异均有显著性。此外，rs923875位点的等位基因频率与欧洲裔美国人比较也存在明显差异（P＜0.05），与美国黑人相比没有明显差异（P＞0.05）；rs1852469位点的基因频率与欧洲裔美国人、尼日利亚约鲁巴人相比差异显著（P＜0.05），与日本人相比差异无显著性（P＞0.05）；rs17137124位点的等位基因频率与尼日利亚约鲁巴人比较有明显差异（P＜0.05），与欧洲裔美国人、日本人比较差异无显著性（P＞0.05）。详见表4。

表3 各SNPs基因型和等位基因频率及Hardy-Weinberg平衡吻合度检验

表4 辽宁地区汉族健康人群FOXP2基因多态分布及与其他人种比较

2.3 辽宁地区汉族人群FOXP2基因5个SNPs之间连锁不平衡检验

连锁不平衡分析结果显示，辽宁地区汉族人群FOXP2基因rs2396722与rs923875之间存在中等程度连锁关系，rs2396722与rs17137124存在中等程度连锁关系，其余各多态位点间存在较弱的连锁不平衡。见表5。

表5 140名辽宁地区汉族人群FOXP2基因多态性连锁不平衡分析

DNA测序结果：测序结果均与酶切结果相符，也未发现其他序列变异。

3 讨论

FOXP2基因编码的FOXP2蛋白包括一个多谷氨酸盐束、一个锌指、一个亮氨酸拉链基序和一个叉头框DNA结合区[1，6]，在成人及胎儿脑组织存在高表达[7]。FOXP2基因所在的染色体7q31缺失或断裂病例均有严重的语言和言语障碍[8-10]，进一步证实FOXP2基因是重要的言语相关基因。此外，FOXP2蛋白可以调控其它基因在发育中的肺组织、心血管、肠道和神经组织的表达。迄今为止，在人脑包括神经轴突、额皮质下层已发现多个FOXP2基因的靶向基因[11]。SPITERI E[12]的体外研究已经证实FOXP2基因的调控作用，而且，其中很多FOXP2基因的靶基因对于中枢神经系统发育如神经轴突的生长起到关键性作用。2008年，新英格兰杂志报道FOXP2基因可以下调CNTNAP2基因[13]，CNTNAP2基因编码突触前膜外伸蛋白（neurexin），在突触发生和突触传递等过程中发挥重要作用[14]。

SNPs，即单核苷酸多态性，是1996年由美国麻省理工学院人类基因组研究中心负责人lander提出的一类新型标记，是指染色体基因水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中发生频率大于1%。与微卫星相比，SNP具有稳定性高的特点，从而避免了标记的高突变率给人群遗传分析带来的困难。此外，位于基因编码区和调控区的SNP有可能直接影响蛋白质的结构或者表达水平。因此，SNPs被广泛应用于疾病易感基因的定位及连锁和关联分析。然而各多态位点的基因型及等位基因频率在不同种族、不同群体之间均存在很大差异。因此，有必要研究基因多态性在不同人群的分布特点以便于进一步的遗传分析。

本研究以辽宁地区汉族人群为研究对象，对言语相关基因 FOXP2的 5个 SNPs：rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031 的基因型及等位基因频率进行了分析，结果显示5个多态位点在辽宁地区汉族人群中均有多态性，其中rs923875的等位基因A、C的频率分别为0.368和0.632；rs2396722的等位基因 C、T的频率分别为0.551和0.449；rs1852469的等位基因A、T的频率分别为0.464和0.536；rs17137124的等位基因C、T的频率分别为0.621和0.379；rs1456031的等位基因 C、T的等位基因频率为 0.547和 0.453。经Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，5个多态位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

笔者同时对以上5个SNPs之间进行了配对连锁不平衡分析，用D’值表示连锁不平衡程度。D’值位于0到1之间，一般将D’＜0.3看作较弱的连锁不平衡，0.3＜D’＜0.7 为中等程度的连锁不平衡，D’＞0.7为较高程度的连锁不平衡。本研究结果显示，rs2396722与 rs923875，rs2396722与 rs17137124之间存在中等程度的连锁不平衡，rs2396722与rs923875均位于FOXP2基因5’非翻译区，二者之间相距94.4kb，rs2396722与rs17137124相距247.8 kb。其余多态位点间存在较弱的连锁不平衡。目前关于控制连锁不平衡的各种因素的研究尚处于初级阶段[15]，影响连锁不平衡的因素较多，其中突变及重组最为研究者所关注。

笔者对5个SNPs的等位基因在不同种族人群中的分布情况进行了比较，结果发现：辽宁地区汉族人群FOXP2基因5个多态位点等位基因分布与西班牙高加索人比较差异均有显著性。此外，rs923875位点的等位基因频率与欧洲裔美国人比较也存在明显差异（P＜0.05），与美国黑人相比没有明显差异（P＞0.05）；rs1852469位点的基因频率与欧洲裔美国人、尼日利亚约鲁巴人相比差异显著（P＜0.05），与日本人相比无显著性差异（P＞0.05）；rs17137124位点的等位基因频率与尼日利亚约鲁巴人比较有明显差异（P＜0.05），与欧洲裔美国人、日本人比较差异无显著性（P＞0.05）。由于国内尚无其他地区人群FOXP2基因相关研究数据，所以本文未能与国内其他地区或民族进行比较。

2004年，GONG氏[16]等选择 FOXP2基因rs1852469、rs1456031及rs2396753三个位点对181个孤独症家系进行传递不平衡研究，结果发现rs1456031可能与汉族儿童孤独症有关。SANJUÁN J[17]等研究了149名精神分裂症患者rs923875的等位基因频率分布并与137名正常对照进行比较，没有发现有意义的阳性结果。PADOVANI A[18]等对210例伴有语言障碍的额颞叶变性患者和200名正常对照进行的FOXP2基因 rs2396753、rs1456031、rs17137124及rs1852469四个多态位点的研究中也未发现基因型和等位基因频率的差异，但结果显示rs1456031TT和rs17137124TT基因型与言语流畅性测验得分相关。笔者选择本文研究的5个多态位点进行了FOXP2基因与功能性构音障碍的相关性研究，结果发现：rs1852469T等位基因可能是决定疾病易感性的重要因素[19]，提示FOXP2基因可能与功能性构音障碍相关。

综上所述，FOXP2基因的5个SNPs：rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 及 rs1456031 在我国辽宁地区汉族人群中均有多态性；与其他种族人群相比，5个多态位点的等位基因频率在不同种族间存在差异。这将为有关FOXP2基因的研究及语言障碍相关疾病的群体研究提供依据和基础，这5个SNPs可以作为遗传标记用于语言言语障碍类疾病的关联分析及连锁分析。最近，TOLOSA[20]等发现SNP rs2253478与精神分裂症的言语障碍有关。因此，FOXP2基因的其他SNPs的分布特点有待于今后的继续研究。

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