大鼠BMSCs的体外分离培养和鉴定

李树贵,于海翔,杨 光*

(1.柳河县医院外四科,吉林柳河 135300;2.吉林大学中日联谊医院）

骨髓间充质干细胞(MSCs）是一种来源于骨髓的成体干细胞,具有自我更新和多向分化能力。它不仅能分化为中胚层的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,近年的研究还发现可跨胚层分化为肝细胞[1]、神经细胞[2、3]、心肌细胞[4],因而引起了更广泛的关注,已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。在体外成功分离培养MSCs是研究其分化机制、基因调控、乃至实验应用的前提。我们采用贴壁法分离培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs）,观察其生物学特性和多向分化能力,并给予鉴定,为下一步实验应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

选取出生5-7天的清洁级Wistar大鼠(体重6.0-8.0 g）,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。低糖DMEM培养基(GIBCO公司）、标准胎牛血清(GIBCO公司）、胰蛋白酶(Sigma公司）。

1.2 骨髓间充质干细胞的分离提取

将新生大鼠颈椎脱臼处死后,放入75%的乙醇内浸泡5 min。无菌条件下取出双侧股骨,去除附带组织,两端剪断暴露骨髓腔。以1 ml注射器吸取低糖DMEM细胞培养液反复冲洗,至骨质发白为止,将所收集的细胞悬液用200目滤网过滤,制备成单细胞悬液。细胞计数后以1.0×106/ml接种到含20%胎牛血清的低糖DMEM细胞培养液的培养瓶内。

1.3 骨髓间充质干细胞的传代培养和扩增

培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。5天后首次半量换液,以后根据培养液颜色变化,每隔3-4天更换全部培养液1次。在贴壁细胞80%-90%融合后,吸尽培养液,以低糖DMEM培养液洗1遍后,加入适量0.25%胰蛋白酶,放入培养箱内消化30 s,倒置相差显微镜下观察细胞成片收缩,弃掉胰酶,加入胎牛血清终止消化,低糖DMEM培养液洗1遍,加入含20%胎牛血清的低糖DMEM培养液,弯头吸管轻轻吹打成单细胞悬液,以1∶2传代扩增培养。

1.4 流式细胞仪测定细胞周期

取生长良好的第3代细胞,细胞数至少1×106个,消化离心收集后,加入到70%冰乙醇中20 min,1,000 rpm离心5 min,弃上清,PBS重悬细胞,200目滤网过滤,PBS洗2遍,以0.3 ml细胞周期染色液重悬细胞,4℃放置30 min,上流式细胞仪检测。

1.5 成骨细胞诱导

第3代细胞传代时,在培养瓶中预先放置玻片,观察细胞70%-80%贴壁后,加入成骨诱导剂,各成分使用终浓度:地塞米松0.1 μ M、β-磷酸甘油钠10 mM、抗坏血酸磷酸盐50 uM。培养液为含10%胎牛血清的高糖D MEM细胞培养液,继续在培养箱内培养,相差显微镜定期观察,每3天半量换液,诱导2周,进行碱性磷酸酶(AKP）染色。

1.6 成脂肪细胞诱导

第3代细胞传代时,在培养瓶中预先放置玻片,观察细胞60%-70%贴壁后,更换成脂诱导培养基,为含20%马血清的低糖DMEM细胞培养液。相差显微镜定期观察,3天半量换液,共诱导2周,进行油红O染色。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

相差显微镜下观察,刚接种时为悬浮于培养液中的大小不等圆形细胞,48 h后可见少数细胞贴壁,为成纤维细胞样细胞,以后贴壁细胞逐渐增多,约在9-12天80%-90%长满培养瓶底,融合成单层,此时传代,传代后的 BMSCs形态更加均一,排列更加有序,呈鱼群样、漩涡状或网状排列,3-4天左右即可长满培养瓶底。传至第6代,形态无明显变化,未出现衰老征象。

2.2 流式细胞仪测定细胞周期结果

通过流式细胞仪测定BMSCs细胞周期,发现平均11.41%的细胞处于S+G2+M期,88.59%处于G0/G1期(图1）,提示BMSCs绝大多数处于静止期,而少数处于S+G2+M期,即增殖期。

2.3 向成骨细胞诱导结果

诱导培养后,细胞变为多角形、不规则形,胞浆中含有较多颗粒,部分细胞聚集成集落,碱性磷酸酶染色呈阳性(图2）。

2.4 向成脂肪细胞诱导结果

诱导培养3 d后,镜下可见小部分细胞内有少量细小脂滴,以后内含脂滴的细胞逐渐增多,并且脂滴增大,融合成团,细胞也由长梭形变为圆形、椭圆形。诱导2周时油红O染色,Giemsa复染,细胞内可见大小不等圆形脂滴空泡,部分被染成特异性橘红色(图3）。未经诱导的细胞胞浆中无脂滴,油红染色阴性。

图1 第3代BMSCs培养3天

图2 BMSCs成骨诱导碱性磷酸酶染色(×200）胞浆中可见黑色颗粒沉着,呈阳性反应。

图3 BMSCs成脂诱导油红O染色、Gimesa复染(×400）胞浆内可见脂肪空泡,被油红染成橘红色。

3 讨论

人们已经从骨、脂肪、脐血等多种组织中成功分离培养出间充质干细胞[5-8],但目前从骨髓中分离培养仍为获取间充质干细胞的主要方法。由于间充质干细胞在骨髓中含量极少,贴壁生长干细胞仅占人骨髓中有核细胞的0.001%[5],故需特定的分离培养方法。1976年由Friedenstein等[8]首先利用贴壁法从小鼠的骨髓中分离得到间充质干细胞,他将全部骨髓细胞置于塑料培养皿中,根据干细胞在特定培养基中贴壁生长的特性,通过换液去除不贴壁的其它杂质细胞后,获得呈梭形的贴壁干细胞。之后人们采用密度梯度离心法和贴壁法相结合,即根据骨髓中细胞成分密度的不同,先离心分离单个核细胞后再接种,之后通过贴壁法进一步纯化。另外还有免疫磁珠法和流式细胞仪筛选法[9,10],但成本较高、技术难度大,加之骨髓间充质干细胞尚未发现其特有的表面标志,故应用较少,目前常用方法仍为贴壁法和密度梯度离心法。

虽然密度梯度离心法可在原代获得较纯化的细胞,但BMSCs的分离密度尚未明确,且离心后仍需用贴壁法进一步纯化,操作步骤复杂,离心过程中不可避免的造成细胞损失,故其优势并不明显。本实验采用贴壁法分离培养大鼠BMSCs,利用干细胞贴壁生长的特性,换液去除悬浮的血细胞,并随着细胞传代,去除其它可贴壁的杂质细胞,经过传代后细胞形态趋向一致,为成纤维细胞样,从而获得纯化的细胞,具有操作简便,费用低廉,成功率高的优点。有研究表明细胞经扩增1、2代后纯度可达 95%和98%[5]。在先前的预实验,小鼠BMSCs分离培养的过程中[11],我们发现随着取材鼠龄增大,细胞活性和增殖能力下降,故本实验选择出生1周内的新生大鼠取材,所获得细胞活性好,增殖能力强。传至第6代,细胞形态无明显变化,未出现衰老征象,适于进一步实验应用。

在使用的血清浓度问题上,国内外不同的实验室所用并不一致,报道多在5%-20%之间[12-14]。虽然也有人对比过不同浓度血清对所培养BMSCs的影响,但因实验条件和所使用的血清来源不同,得出的结论也并不一致[15-17],故尚无统一标准。本实验使用浓度20%的国产胎牛血清,细胞生长良好,并未过早出现生长停滞和分化的现象。对于细胞接种密度,如果密度过小,会造成细胞生长缓慢,甚至死亡;而密度过大,细胞间产生接触抑制,也将致使生长缓慢,同时由于细胞代谢旺盛,导致换液频繁,加大了工作量,增加了污染机率。经过摸索,我们认为原代接种时细胞密度4.0×105/cm2左右比较适合。

在相差显微镜下观察,刚接种时为大小不等的多种细胞悬浮在培养液中,BMSCs逐渐贴壁生长,并拉长为成纤维细胞样,经换液和传代去除杂质细胞后,所获细胞形态均一,排列有序,培养3～4天即可传代扩增,表现了较强的增殖能力。

本实验通过流式细胞仪检测了第3代BMSCs的细胞周期,发现绝大部分细胞处于静止期G1/G0期,少部分处于S+G2+M期,这和大多数文献报道的相一致[18],说明绝大部分细胞处于静止态,但保留自我更新和增殖能力,少部分处于功能态,符合干细胞的生长特性。具有多向分化能力是干细胞的另一主要特性,本实验对所培养的BMSCs进行成骨和成脂肪诱导分化,鉴定结果显示实现了向成骨和脂肪细胞分化。而未经诱导的细胞碱性磷酸酶染色为阴性,排除了所获细胞为成骨细胞或成纤维细胞。

BMSCs的表面抗原表型并不是单一的,而是兼有间充质细胞、上皮细胞和肌肉细胞的特点,可表达细胞粘附分子、生长因子、细胞因子、细胞外基质成分等多种抗原。目前尚未发现可作为BMSCs标志物的特异性抗原[19,20],故无法直接鉴定得到的BMSCs。一般的鉴定方法都是通过培养传代后,对所培养的细胞根据干细胞的生物学特性逆推,从而得知是否是BMSCs。本实验所培养的细胞由骨髓取材,在特定的培养基中呈成纤维细胞样贴壁生长,形态结构具有幼稚细胞的特征,并可分化为成骨和脂肪两种不同的终末细胞,故可认为是骨髓来源的间充质干细胞。

综上所述,我们在体外成功的分离培养和扩增了大鼠骨髓来源的间充质干细胞,熟悉了其一般生物学特性,并通过检测其多向分化能力给予鉴定,为下一步实验应用奠定了基础。

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