延迟性异种移植排斥反应机制及其对策研究进展

张 恒，杨洪吉

(1.泸州医学院临床医学系，四川泸州646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院器官移植中心，四川成都610072)

随着临床医学的发展和免疫抑制剂的开发利用，器官移植已经成为治疗终末期器官衰竭患者的首选方法。然而临床同种器官移植面临着越来越严重的供器官短缺局面，这就促使人们对异种移植进一步的探索。由于猪易于饲养繁殖，器官尺寸与人类相匹配，生理和代谢方面与人类近似，人猪共患病发生可能较小，涉及伦理问题较少，并可通过基因修饰来增强供体器官的匹配性，所以是公认的最适合用作异种移植供体的物种[1]。但作为远缘移植，将产生远比同种移植或近缘异种移植更强烈和更复杂的免疫排斥反应，包括超急性排斥反应(hyperacute rejection，HAR)、延迟性异种移植排斥反应(delayed xenograft rejection，DXR)、急性及慢性异种排斥反应。随着清除补体(应用眼镜蛇毒因子等)、免疫吸附、血浆置换、器官吸附等方法的应用和转人补体调节蛋白(complement regulatory protein，CRP)基因猪、αGal抗原基因敲除(1，3-galactosyltransferase geneknockout，GTKO)猪的问世[2]，使 HAR 的免疫屏障得以控制，目前影响异种移植走向临床的主要免疫学障碍是DXR。因此，研究异种移植中DXR的发生机制及其应对策略具有重要的意义。

1 延迟性异种移植排斥反应的机制

DXR是近缘器官移植或控制了HAR的远缘移植在恢复血流24小时内所发生的、移植后数天至数周内移植物丧失活性的过程。目前认为，DXR主要是由体液免疫所介导的排斥反应，但细胞免疫也参与其中，其主要特点是：①供者器官移植物血管内皮细胞的激活;②受者单个核细胞(主要是单核-巨噬细胞和NK细胞)向供者器官移植物内浸润。一方面，内皮细胞激活后，发生多基因的转录，产生和分泌多种凝血因子和促炎症因子，引起以炎症为特征的病理变化;另一方面，单个核细胞的募集、浸润，并表达可与IgG抗体结合的IgG Fc受体，二者结合后识别内皮细胞表面的抗原，诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。两者共同作用最终引发类似于HAR的移植物水肿、间质出血和血管内凝血，导致移植物失活[3]。研究表明，DXR发生和发展主要涉及以下三个因素：内皮细胞表面抗原与异种反应性抗体的结合、内皮细胞的激活和移植物NK细胞的活性。

1.1 抗原与异种反应性抗体的结合 目前认为异种反应性抗体(体内的天然抗体和移植后的诱生抗体)是启动DXR的首要因素，这些抗体与供者血管内皮细胞表面的抗原相结合，通过激活补体级联反应，使内皮细胞活化，引起血管内凝血，最终导致移植物坏死。Chen等[4]在猪到狒狒的异种心脏移植中发现，将表达人CRP的猪心脏移植到狒狒体内后11天内，狒狒体内逐渐增加的IgM与猪血管内皮细胞上的αGal抗原结合，导致了DXR的发生，使移植心脏被排斥。此外，在GTKO猪到狒狒的异种肾移植中，狒狒体内诱生的非抗αGal抗体也是导致DXR的重要因素[5]。

1.2 内皮细胞的激活 与HAR中的I型内皮细胞激活(不需要基因的转录和蛋白质的合成)不同，DXR中发生的是Ⅱ型内皮细胞激活。Ⅱ型内皮细胞激活是以多种基因的转录和蛋白质的合成为特征，包括了NF-κB转录因子的参与，使促炎症因子[E选择素，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等]、促凝血因子(TF)和其他血栓形成调节因子等大量表达，引起移植物内广泛的炎性改变和血栓形成。目前认为Ⅱ型内皮细胞激活是由NF-κB激活介导的基因转录激活造成的。在静息情况下，NF-κB异二聚体在细胞质中与其抑制蛋白I-κB结合，NF-κB无法转位入细胞核启动基因转录;当接受外界信号[如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、氧自由基]刺激时，I-κB 被磷酸化和泛素化降解，NF-κB转位入细胞核，并与DNA的κB反应元件结合，从而启动基因的转录表达[6]。有学者在猪到非人灵长类的器官移植研究中发现移植器官的小动脉内存在激活的血小板、中性粒细胞和单核细胞，血管内皮细胞有 E选择素、TF和ICAM-1等表达，且内皮细胞表面沉积大量纤维蛋白[7]。此外，Vetr等[8]用 TNF、IL-1 或 LPS 激活猪血管内皮细胞的研究中发现有gp65和gp100新抗原分子的表达。

1.3 自然杀伤细胞(NK细胞)的活性 NK细胞主要通过NKR直接识别靶细胞或通过FcγRⅢ间接识别结合在靶细胞上的抗体引发对靶细胞的杀伤。有证据表明，人NK细胞的抑制受体不能识别猪的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子;其激活受体(主要是NKp44和NKG2D)可直接识别猪内皮细胞的配体(目前 NKp44所识别的配体尚不清楚，NKG2D 识别猪内皮细胞的配体 ULBP-1)[9，10]。二者共同作用造成了NK细胞在内皮细胞中黏附、募集，向组织内浸润，并主要通过以下两种机制引发DXR：①NK细胞对内皮细胞的激活：NK细胞与移植物血管内皮细胞直接接触并释放一系列的细胞因子(TNF-α、淋巴毒素 α、IL-1、INF-γ 等)来诱导内皮细胞的激活。Von Albertini等[11]发现激活的NK细胞还可以通过NF-κB途径诱导内皮细胞表达E选择素和IL-8来激活内皮细胞。②NK细胞对内皮细胞的直接杀伤：NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤移植物血管内皮细胞，且这种杀伤作用不能被抗细胞凋亡基因BCL2及Fas与FasL途径所抑制。此外，人NK细胞还能直接识别猪内皮细胞上的αGal抗原;敲出αGal抗原的猪内皮细胞能减少补体介导的细胞毒作用，但并不能抑制NK细胞直接对内皮细胞的细胞毒作用[12]。NK细胞的活性还受一系列细胞因子的调控。IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、TNF-α等可增强NK细胞对内皮细胞的杀伤作用[13]，而前列腺素(PGE1、PGE2、PGD2)和肾上腺皮质激素等则可一定程度抑制NK细胞活性。

2 延迟性异种移植排斥反应的防治策略

2.1 抑制抗原-抗体反应 猪血管内皮细胞上的αGal抗原表位是猪到灵长类异种移植中发生免疫排斥反应最主要的原因。研究发现，在转人衰变加速因子(DAF，CD55)基因猪到狒狒的异种移植中辅以静脉注射GAS914耗竭抗αGal抗体并结合免疫抑制可阻止DXR的发生[14]。随着GTKO猪的诞生以及在 GTKO猪内表达 α1，2岩藻糖基转移酶(αFT)都能有效地克服猪到灵长类异种移植中DXR[15]。Kuwaki等[16]在 GTKO 猪心脏异位移植到狒狒的模型中，给已免疫抑制的狒狒注射抗CD154单克隆抗体，结果表明狒狒体内非抗αGal抗体水平没有升高，移植心的存活时间明显延长。然而，Tazelaar等[17]在猪到狒狒异位心脏移植的研究中证实，移植心发生DXR最早的病理变化是心肌细胞空泡化，而不是血管内凝血或心肌细胞的凝固性坏死。这说明DXR的发生可能不依赖Gal抗体或非Gal抗原引起的免疫应答。目前机制尚不清楚，待进一步研究证实。

2.2 抑制内皮细胞的激活和凝血作用

2.2.1 抑制NF-κB激活 ①表达I-κB基因：在内皮细胞表达I-κB可阻止NF-κB向细胞核内转移，从而抑制Ⅱ型内皮细胞激活和DXR的发生。研究发现，用重组腺病毒将I-κBα基因转入猪血管内皮细胞，可抑制NF-κB与DNA的结合，从而抑制TNF-α引起的 VCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8和组织因子的表达[18]。而 Goodman 等[19]在的研究中证实，腺病毒介导的I-κBα过度表达于猪血管内皮细胞可抑制NK细胞对内皮细胞的激活，但不能抑制其介导的细胞毒作用。②表达小干扰RNA(siRNA)基因：应用的RNA干扰技术构建针对NF-κB p65的siRNA，可降低NF-κB基因在转录后的表达，从而抑制Ⅱ型内皮细胞的激活。Ye等[20]研究证实通过颈静脉将siRNA注射入小鼠体内成功抑制了NF-κB p65在心脏的表达，阻止了内皮细胞激活。③高表达A20等抗凋亡基因：A20是一种由TNF和IL-1等诱导对NF-κB基因表达进行调控的蛋白，可抑制TNF和IL-1的各种生物学功能。研究表明，将A20和E选择素、IL-8、TF、I-κBα 基因共表达牛内皮细胞发现 A20可抑制TNF、LPS、佛波脂(PMA)和过氧化氢对内皮细胞的激活[21]。Oropeza 等[22]在转 A20 基因猪异种心脏移植的研究中发现表达人A20的转基因猪血管内皮细胞不仅能抑制TNF-α介导的细胞凋亡，还能减轻移植心的缺血和再灌注损伤。此外，Bcl-2、Bcl-XL、A1等基因的过度表达也能通过抑制NF-κB防止内皮细胞发生凋亡。

2.2.2 表达血红素加氧酶-1(HO-1)基因 HO-1基因是另一个对内皮细胞具有保护功能的基因，目前认为HO-1基因的表达可以起到抗氧化和抗炎的作用。Song等[23]在豚鼠到大鼠的肝脏移植中证实，HO-1基因的表达抑制了内皮细胞的激活，延缓了DXR的发生。

2.2.3 转人补体调节蛋白基因和免疫抑制剂抗补体激活 培育转基因猪使其表达一种或多种人CRP，如 DAF、膜辅助蛋白(MCP，CD46)、同源限制因子(HRF)和膜反应性溶解抑制物(MIRL，CD59)等，用人血清处理这种表达人CRP的猪血管内皮细胞，内皮细胞表面补体沉积减少，补体介导的细胞毒作用受到抑制。研究表明，表达人DAF的猪血管内皮细胞可减少补体的沉积，抑制补体介导的内皮细胞激活[24]。此外，陈栋等[25]在猪到猕猴的异位心脏移植中发现应用中华眼镜蛇毒因子(Y-CVF)可完全清除猕猴体内补体，延长移植心的存活时间，但移植心脏排斥后仍有一定的补体沉积，目前机制尚不清楚，待进一步研究证实。

2.2.4 抑制凝血作用 控制凝血调节因子可抑制内皮细胞的激活和血栓形成。研究表明用人血灌注表达人CD39的转基因小鼠的胰岛，其凝血时间较对照组非转基因小鼠的胰岛显著延长，且对胰岛的功能无影响[26]。Chen 等[27]在表达组织因子途径抑制物(TFPI)或水蛭素的转基因小鼠心脏移植给大鼠的实验中发现这些转基因小鼠的心脏存活时间超过100天，较对照组非转基因小鼠心脏移植明显延长。此外给予系统的药物治疗(如静脉输入抗凝血酶Ⅲ因子或选择性抑制猪vWF因子与人GP1b蛋白的结合)也是抑制凝血的途径[28，29]。目前研究者们正在建立以GTKO猪为基本模型，表达人TFPI、水蛭素、血栓调节蛋白和CD39一种或几种基因的动物模型来克服DXR中的凝血。

2.3 抑制NK细胞的活性

2.3.1 表达经典和非经典HLAⅠ类基因 人NK细胞通过NKR识别经典和非经典的HLAⅠ类分子，并通过负反馈抑制自身的活性。Seebach等[30]在猪内皮细胞上转染HLA-A2、HLA-B27和HLA-Cw3三种经典的HLAⅠ类分子，发现只有HLA-Cw3可以部分抑制NK细胞对内皮细胞的杀伤作用。Forte等[31]发现表达HLA-Cw4的猪血管内皮细胞能减少NK细胞的黏附和细胞毒作用，但同时表达HLACw4和HLA-Cw3的猪血管内皮细胞并不能完全克服NK细胞介导的细胞毒作用。此外，非经典HLAⅠ类分子不具有或很少具有多态性，可比经典的HLAⅠ类分子更有效地抑制NK细胞。研究发现表达可溶的HLA-G1和HLA-E均能有效地抑制NK细胞对猪内皮细胞的细胞毒作用[32，33]。

2.3.2 表达NK细胞受体的配体 ①表达NK细胞抑制受体的配体：体外实验证明，在猪血管内皮细胞表达人巨细胞病毒蛋白UL18可抑制人体NK细胞对内皮细胞的直接杀伤作用，并抑制NK细胞释放IFN-γ[34]。②表达抑制NK细胞激活受体的配体：在猪血管内皮细胞表达人巨细胞病毒蛋白UL141可抑制CD155与NK细胞激活受体CD226(DNAM-1)和CD96(TACTILE)结合，从而抑制了NK细胞介导的细胞裂解[35]。此外，Lilienfeld 等[10]用 RNA 干扰pULBP1基因可部分抑制NK细胞激活受体NKG2D，用抗pULBP1多克隆抗体可完全将其抑制，从而阻遏了NK细胞的介导的细胞毒作用。

3 展望

在利用基因工程技术初步克服了HAR的今天，DXR是异种移植排斥反应中的主要障碍。随着对其认识的不断深入，目前在应对策略上已经取得了很大的进展，但并不能完全解决问题。考虑到其是多种因素共同作用下的一个复杂的免疫病理过程，采用以GTKO猪为基本模型并联合其他策略将是进一步研究的趋势。

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