植物中多酚的研究进展

于 帅，杜 彬，杨越冬，王同坤

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066600)

植物多酚是含有酚羟基和羧基的一类代谢产物成分，自然界中发现的酚酸类物质的主要骨架类型有C6-C1型和C6-C3型，广泛存在于蔬菜、水果、豆类、谷物类、茶等植物中［1］。多酚的独特结构使其具有很多的药理功能，如:抗肿瘤、抗突变、抗变态反应、抗氧化、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等［2～7］，已广泛应用在食品、化妆品、日用化学品、医药以及保健品等领域［8］。

随着天然产物开发的逐渐兴起，植物多酚因其在植物界分布的广泛性、生理功能的多样性以及来源丰富性等特点，逐渐成为当前天然产物化学研究的热点［9］。近年来，人们通过比较不同植物或不同品种植物中总多酚含量，试图从食品或药材中寻找富含多酚的植物材料，以便进一步开发利用多酚［10～12］，目前研究较多的有苹果多酚，茶多酚，葡萄多酚，柑橘多酚等［13，14］。笔者在此重点讨论植物多酚的提取、分离及测定方法。

1 多酚类物质的提取

目前对植物多酚的提取工艺研究较多，植物多酚的提取技术已经由传统的提取法逐渐转向新提取技术［15，16］。其中传统的提取法有溶剂浸提法和金属离子沉淀法，近几年来出现了一些新的方法，如:树脂吸附法、微波提取法、超声波提取法及超临界流体萃取法等。

1．1 溶剂浸提法

溶剂浸提法属于传统的多酚提取方法。常用的溶剂有水、甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液、乙酸乙酯等。根据相似相溶原理，多酚易溶于这些溶剂，溶剂浸提法还是目前工业化生产的主要方法［17］。

该方法提取过程比较简单，但在生产过程中要用到多种有机溶剂，且有机溶剂的用量大;工序多，需多次蒸馏，工艺繁琐复杂;加热时间过长，多酚易氧化;操作不够安全。

1．2 金属离子沉淀法

金属离子沉淀法是利用多酚能与某些金属离子络合成结晶性沉淀物的特点，使其从浸提液中分离出来，实现与其它杂质的初步分离。常用的金属离子有Al3+，Ca2+，Fe2+，Mg2+，Zn2+等。其中，Zn2+，Al3+是较适宜的弱酸性沉淀剂［18］。

该方法的特点是经热水浸提后，加入沉淀剂即可得到多酚与金属离子的结晶性沉淀物，不必浓缩浸提液，可在一定程度上降低能耗。同时，由于这些沉淀的选择性较高，产品的纯度相对较好。但在其后的稀酸转溶过程中多酚损失较大，而且沉淀剂有的是有一定毒性的金属离子，有的偏碱性易造成多酚的氧化。因此，在产品的纯度、收率、成本及安全性上仍不能完全令人满意。另外，由于该方法使用了重金属作沉淀剂，其产品是食品和医药行业所不能接受的。

1．3 树脂吸附法

树脂吸附法提取多酚是利用树脂能对多酚发生吸附—解吸作用的特性来实现多酚与其它浸提物组分之间的分离。根据所采用的树脂类型的不同可分为吸附柱分离法、离子交换柱分离法和凝胶柱分离法;按其极性大小和所选用的单体分子结构不同，可分为非极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂和极性大孔吸附树脂。徐向群等［19］、董文宾等［20］研究了用大孔吸附树脂制备茶多酚精品的工艺，得出了最优的吸附条件。

利用树脂吸附法提取多酚，技术路线简单，操作方便，能耗较低;操作条件温和，可避免有效成分的失活，产品收率和纯度好。尤其是整个过程中使用的有机溶剂主要是乙醇，具有回收容易、无毒等优点，而且可连续性生产，有利于大规模工业化生产。

1．4 微波辅助提取法

微波辅助提取(Microwave-Assisted Extraction)技术是近年来兴起的生物活性物质提取技术，基本原理是利用微波场中分子发生高频的运动，扩散速率增大，使多酚等浸提物在微波的辐射作用下快速浸取出来。通常研究提取剂、提取剂浓度、料液比、微波功率、提取时间等实验因素对多酚类物质提取的影响［21，22］。

利用微波辅助提取所需时间短，因此大大减少了多酚在高温下的氧化，提高了产品的品质与收率。其具有投资少、设备简单、使用范围广、重复性好、操作时间短、溶剂用量少、效率高且物料受热均匀等优点。从报道的研究结果表明，利用微波提取法，多酚的提取率明显高于回流提取法及超声波提取法［23，24］。但由于微波的温度较高，其反应比较剧烈，易沸腾，操作要小心。

1．5 超声波提取法

超声波提取法利用超声波的机械破碎和空化作用，加速多酚等浸提物向溶剂的扩散速率，缩短浸提时间。通常研究浸提剂浓度、提取时间、料液比、提取温度及提取次数对多酚提取效果的影响，并运用正交试验对多酚的提取条件进行优化［25，26］。

该方法有操作简便，仪器设备便捷，提取效率高，温度要求低，萃取速度快，萃取完全，适应性广等优点。超声波提取方法优于普通的溶剂提取法［27］。但是也存在一些不足，如:超声波提取通常持续工作时间较长，消耗溶剂量大。

1．6 超临界流体萃取法

超临界流体萃取(supercritical fluid extraction)技术是一种正处于积极开发阶段的新型分离技术，在较低温度下，不断增加气体的压力时，气体会转化成液体，当温度增高时，液体的体积增大，对于某一特定的物质而言总存在一个临界温度(Tc)和临界压力(Pc)，高于临界温度和临界压力后，物质不会成为液体或气体，这一点就是临界点。在临界点以上的范围内，物质状态处于气体和液体之间，这个范围之内的流体成为超临界流体(SF)。从固体或液体中萃取某种高沸点和热敏性成分、以达到分离和提纯的目的。超临界流体萃取技术为多酚的深度开发提供了技术基础［28］。

超临界流体粘度低、扩散性高，具有更高的传质效率，基本可以实现定量萃取和完全萃取。其选择分离效果好，提取率高，产物没有有机溶剂残留，有利于热敏性物质和易氧化物质的萃取［29］。超临界流体萃取所得多酚的纯度很高，这是其它工艺所不能达到的。超临界流体萃取以无毒无害的二氧化碳作为超临界溶剂，特别适合于医药、食品添加剂等产品的提取，可作为通用高效的分离技术而应用。王朝瑾等［30］通过对绿茶茶叶的浸提试验，确定了超临界二氧化碳萃取茶多酚的最佳工艺条件，并通过与溶剂法萃取茶多酚的比较，确定超临界二氧化碳萃取茶多酚的可行性。但超临界萃取法提取多酚尚有一定的技术障碍，主要表现为一次的提取率很低，分离过程在高压下进行，设备一次性投入大。

2 多酚总量的测定方法

关于多酚的测定方法近年来有很多报道，根据多酚的结构特性、络合性能等理化性质，目前应用于多酚类化合物的测定方法主要有高锰酸钾滴定法、光谱分析测定法、色谱分析测定法等。

2．1 高锰酸钾滴定法

本方法是传统的测定方法，具有一定的代表性。它是利用多酚类化合物中酚羟基的还原性，以1．0 g/L靛红溶液为指示剂测定食品中的多酚类物质含量。高锰酸钾是强氧化剂，被测溶液中的还原性物质一般均能被氧化，所以用这种方法测定选择性不高。李思睿等［31］对该方法所使用的各种药剂性状及其稳定性做了研究，以便在检测中更合理地使用各种药剂，减少误差的产生。

2．2 光谱分析测定法

2．2．1 可见分光光度法 多酚是一类具有多酚羟基的物质，在一定条件下可与金属离子发生显色反应用于定量。光谱分析测定法多以福林-肖卡(Folin-Ciocalteu)比色法、分光光度法、流动注射法和红外吸收光谱法等分析技术来测定样品中多酚的总量。

(1)福林肖卡比色法 此法是我国测定茶多酚的国家标准方法。作为衡量天然产物中总酚含量的方法［32］，最大吸收峰为765 nm。Folin-Ciocalteu试剂是一种强氧化剂，其还原型为蓝色，多酚的量与蓝色的深浅成正比［33，34］。目前国际上均采用没食子酸(GA)作为标准物质［35］，用来定量多酚的含量，是生物学实验中的重要试剂［36］。福林肖卡在实际中应用较广［37～39］，如李巨秀、王柏玉［37］以桑椹为原料，没食子酸为标准物质研究了用福林-肖卡比色法测定桑椹提取液中多酚类物质含量的最适反应条件;李静等［40］对Folin-Denis法(即福林-酚法，水果及其制品中测定多酚含量的另一种方法)和Folin-Ciocalteus法测定水果及其制品中总多酚含量进行了研究。Folin-Ciocalteus法比Folin-Denis法更加稳定、灵敏和准确。并且此法简单、敏感、精确，对特异性和标准化的测定十分有利，能在一定程度上克服植物性材料中一些限制性和多变性因素，适宜样品总多酚含量的测定。但其测出的是多酚类化合物相对总量，受多酚类物质的结构影响较大［41］。故在试验中，应对结果中干扰性物质进行修正。

(2)酒石酸亚铁分光光度法 1953年，Roux等建立植物多酚的酒石酸亚铁545 nm分光光度测定法，其原理是在一定条件下，食品或植物组织中的多酚类物质能与酒石酸亚铁形成蓝紫色络合物，络合物的吸光度值在一定的浓度范围内与多酚类物质的浓度成正比［42］。此后回瑞华等［43］，采用三波长-光谱法消除随浓度不同发生的本底漂移及吸收峰不对称给定量分析造成的影响，建立了酚类物质酒石酸亚铁分光光度测定法。酒石酸亚铁分光光度法是多酚类化合物测定中引用最多的快速分析方法，也是我国测定茶多酚的国家标准方法。

雷昌贵等［44］发现由于测定方法本身存在的局限性。分光光度法测定多酚含量时存在吸收峰不对称给定量带来的影响，回瑞华等［45］在此基础上采用三波长分光光度法来弥补吸收峰不对称这一不足，取得了较好结果。

(3)其他显色方法 除了以上几种显色反应外，还有KFe［Fe(CN)6］法［46］，此方法较适用于食品中微量多酚类化合物的测定。原理是利用多酚类物质在碱性条件下能与铁氨离子生成深红色络合物。钼酸铵分光光度法，依据的是多酚类物质在酸性条件下与钼酸铵生成黄色钼酸酯的显色反应［47］。另外还有多酚在酸性条件下与磷钼酸铵结合形成磷钼酸酯的反应等［48］。这些方法各有利弊，在此不再赘述。

2．2．2 原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法测定多酚的含量与可见分光光度法的不同之处在于后者测定的是络合体系中络合物含量，而前者是多酚与金属离子的反应，然后通过测定络合体系上清液金属离子或剩余的金属离子量而间接测定之。廖晓玲等［49］采用原子吸收分光光度间接测定法，利用茶多酚与碱式乙酸铅络合反应，产生难溶于水的黄色沉淀，将络合体系离心后，用原子吸收法测定上清液中过量的铅离子，间接测定茶多酚的含量。

原子吸收分光光度法选择性比高锰酸钾滴定法要高，但增加了沉淀离心分离步骤，操作比较繁琐。与Folin-Ciocalteu试剂法相比，本方法更适合于测定食品中的高分子量的多酚类化合物，且干扰要比后者要小。

2．2．3 红外光谱法 近红外光谱的波长范围为780～2 526 nm，其信息主要是分子结构中的C-H，OH，C-O等基团的倍频吸收及其伸缩振动、弯曲振动的合频和差频产生的吸收峰。在特定波长处，不同样品的吸收值差异反映样品中酚组分含量的不同［50］，可定量快速检测总儿茶素在茶多酚中的含量［51，52］。

2．2．4 流动注射法 流动注射分析法以其高精度、高效率及装置简单等优点被广泛应用。此方法测定的是还原型多酚的含量，因此对样品的测定结果较标准法偏低。余宇燕等［53］建立了流动注射化学发光法测定茶饮料中的茶多酚的新方法。

3 多酚的分离及组分含量的测定

测定多酚的多种组分含量，需采用能够进行组分分离的色谱法来定量分析测定。分离后的成分能够与一定的显色剂作用，然后比色定量。色谱法是近代分析化学中发展最快、应用最广的分离分析技术。在化学、生物学等领域发挥着越来越重要的作用。20世纪50～60年代纸色谱(PC)和薄层色谱(TLC)开始应用于茶多酚的分析。随着工业的发展出现了现在广泛使用的气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳测定法(HPCE)等［54］。由于这些方法专属性强、灵敏度高、重复性好，可同时用于多酚的分离和测定，已广泛应用于商品茶多酚、茶叶或茶饮料、化妆品等实际样品的含量测定。

3．1 薄层色谱法(TLC)

薄层色谱法由Stahl于1958年建立，具有设备简单、成本低、操作方便、分离速度快、灵敏度及分辨率高等优点，已成为一般实验室必不可少的分离分析手段［55］。并广泛应用于中药有效成分的分离、提取和研究及药物和毒物的鉴定。通过适当地选择吸附剂，既可用于吸附色谱法，也可用于分配色谱法。薄层色谱法的分辨率高于同固定相的柱色谱，为进一步进行HPLC流动相的分析提供依据。因此，不失为初步定性检测的一种较理想的方法。缺点是其分离多酚组分不多且定量也不够准确。

3．2 气相色谱法(GC)

气相色谱法是一种极为有效的分离方法，可以分离、分析复杂的多组分混合物，但一般用于分离弱极性、易挥发、热稳定性高的有机物。高效能的色谱柱、高灵敏度的检测器以及计算机处理技术，使其在食品工业、生物技术、农副产品等领域都得到了广泛的应用。但植物多酚是强极性、不易挥发且结构复杂的有机物，分子量在500～3 000 u之间，分子量越高，热稳定性越弱。为了降低植物多酚的极性和提高挥发性，常常需要加入硅烷化试剂使其衍生化。

3．3 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC)于1960年后期开始应用。是色谱法中的一个重要分支，据估计，自然界70%以上的化合物均可用这种方法分析。试验中确定色谱条件包括:色谱柱的确定，适宜的固定相为未修饰的C18填料，如Spherisorb ODS1;检测波长的确定;流动相及比例的确定，洗脱溶剂为水-甲醇/乙醇、水-乙腈体系，通常加入乙酸或磷酸盐缓冲液来抑制羧基和酚羟基的电离;流速对分离度的影响;温度对分离度的影响;进样量等［56，57］。

目前，高效液相色谱法是实验室应用最广泛、最有效的分离分析技术之一，具有分辨率高、分析速度快、重复性好、定量分析精确度高等优点，并可用作实验室小量色谱纯样品的制备，所以发展特别迅速。在短短的几年时间内，已被广泛应用于食品中多酚类化合物等非挥发性成分的分离鉴定。

高速逆流谱［58］、高效液相色谱-化学发光法及多种仪器联用新方法的建立［59］，将进一步提高酚酸检测的灵敏度和准确性。高速逆流色谱作为一种不需要固态载体的液-液分配色谱，现已在天然产物分离纯化领域得到广泛应用。与传统柱层析法相比，它具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点［60］。KumarN S［61］以正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂，通过高速逆流色谱分离茶叶提取物中的7种儿茶素，EGCG，ECG与EGC的纯度可达91% ～99%。

3．4 超临界流体色谱(SFC)

SFC一般用CO2做流动相，既可分析GC难以处理的高沸点、热不稳定的样品，又比HPLC的柱效高、分析时间短。SFC可以使用GC和LC检测器，也可与MS-IR等在线联接，进行简便、快速的定性定量分析。但是由于流动相较贵，该技术适宜于萃取高价值的油脂(包括天然功能性油脂)、精油、内酯等极性较低的天然产物有效成分，应用受到限制。

3．5 毛细管电泳测定法(HPCE)

毛细管电泳测定法(HPCE)是测定多酚含量的电化学分析方法，是指溶质以电场为推动力，在毛细管中按淌度和分配行为的差异而实现的高效快速分离的新技术［57］。HPCE是近十几年来发展很快的一种高效分离技术，具有灵敏、高效、快速、进样体积小、成本低，溶剂消耗少和抗污染能力强等特点。而且与HPLC法相比溶剂无毒性。

毛细管电泳方法是一种连续快速分离茶叶中儿茶素组分的新方法，可在8 min内完成一个样品全分离，进样量少、无环境污染问题。魏泱等［62］报道，在采用毛细管区带电泳分析绿茶时，高压液相法在准确性和灵敏性方面比毛细管区带电泳法更有优势，而且高压液相法可用于样品的制备和半制备;但毛细管区带电泳法的分离效率更高，可解决反相高压液相法分离多酚化合物出现的峰展宽现象，而且由于所需样品少，分析速度快，在样品分析中更具有实用性和经济性。

4 结 语

近年来，国内对植物多酚的研究比较活跃，如何充分、合理、科学地利用我国丰富的植物多酚这一绿色资源已经成为一项重要课题。在提取方面，传统的溶剂提取法及沉淀分离方法制备多酚，产品在颜色、纯度和溶剂残留等方面不能满足国内外用户日益提高的要求，尤其是在工艺中使用大量易燃易爆的有机溶剂，有的甚至使用有毒的氯仿，金属离子等溶剂，致使安全性差，质量差，综合成本高。微波、超声波萃取技术和超临界流体萃取技术具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点，正在得到广泛应用。在总量测定方面，虽然有很多方法提出，但其操作过程还不够成熟，在摸索过程中，应用较多的还是经典的可见分光光度法。在分离测定方法中，高效液相色谱法已经逐步代替薄层色谱法，其具有分辨率高、分析速度快、定量分析精确度高等优点，是正在崛起的方法，得到了广泛的应用。随着科学的发展，我们应该在改进传统经典方法的基础上，广泛地开发和应用新技术。这样既可生产出高质量的多酚，又可解决传统工艺的一些弊端，将会有很好的发展前景。

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