关于微生物分子生物学的研究

沈阳师范大学化学与生命科学学院 孙增明

关于微生物分子生物学的研究

沈阳师范大学化学与生命科学学院 孙增明

一、微生物简介

微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。人类疾病中有50%是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第一位。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物,一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，使人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近被控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。

微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然，有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪、面包、泡菜、啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1 000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1 000个叠加在一起只有句号那么大。想象一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。

微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其他细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中被筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生潜力极大，称为环保微生物；在极端环境例如高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，已经发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

二.现代环境分子生物学研究方法

对环境微生物进行分子生物学研究的方法主要有同源性分析法、梯度凝胶电泳方法、PCR技术和核酸分子杂交技术等。

1. 16S rRNA同源性分析法。核蛋白体RNA(ribosomalRNA)是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，在蛋白质翻译中起着重要的作用。rRNA基因同源分析方法是目前研究的热点，是多种分子生物学技术的组合，它通过对微生物的rRNA进行分析，揭示微生物的多样性，是分子微生物生态学的重要方法，目前取得了大量的成果。同源性分析方法中包括环境样品的总DNA提取、探针及引物的设计、PCR扩增、DGGE、TGGE、基因文库的筛选、序列测定及分析、系统树的构建和原位杂交等技术。PCR扩增是分子生态研究的基础和关键步骤，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，可以在界、门、纲、目、科、属甚至在种的水平上设计特异性引物，该引物核苷酸序列应与待扩增的微生物类群的rRNA全部匹配，但与其他类群的rRNA有错配或尽可能少。

2. 梯度电泳技术。DGGE技术通过指纹图谱直接再现群落结构，避免了分离纯化培养所造成的分析上的误差，因此成为研究微生态的强有力工具。DGGE用于分析确定环境中微生物群体的遗传多样性、环境中微生物变化的动态监测和微生物菌株的筛选，可避免对多个无遗传差别或差别很小的菌株进行繁琐的各种表观特征研究，近十年已被广泛应用于各种环境微生态研究中。

3. PCR扩增技术。PCR技术在结合其他技术如竞争PCR、RAPD、AFLP、RFLP等的基础上可对被扩增序列作定性或定量分析，用于研究微生物群体结构。

PCR-RFLP是将PCR技术和RFLP技术结合用于检测PCR降解基因在环境中的存在情况，当将不同种细菌的DNA经多种限制性内切酶进行酶切时，内切酶在其上的识别位点的数目和距离会发生改变，产生相当多大小不等的DNA片段，在进行凝胶电泳时，由于迁移率不同形成不同的带，因此可通过对酶切产物的分析，探测该基因的多态性，从而得到不同污染地区降解某物质的微生物群落生物多样性。

4. 核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术，是利用一段已知序列并带有放射性同位素32P等标记的多聚核苷酸作探针，检测复杂的核酸分子混合物中是否存在与之互补目标序列的技术。印迹转移杂交是用放射性同位素探针与滤膜上的DNA或RNA分子杂交，经显影曝光显示印迹。印迹转移杂交分成两种，一种是Southern印迹杂交，用于检测DNA样品；另一种是Northern印迹杂交，用于检测RNA样品。原位杂交法是将标记的探针（如荧光标记探针）加在组织切片（包括染色体）上，进行显微照相检测目标基因或目标序列在染色体上的位置。在核酸原位杂交技术中，荧光原位杂交应用较为广泛。

分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性，是人类在认识论上的重大飞跃。现代分子生物学研究手段对于深入开展微生物生态学研究具有日益重要的意义。同源性分析法、梯度凝胶电泳方法、PCR技术和核酸分子杂交技术作为代表性分子生物学分析方法，各有其优缺点，但在未来现代微生物研究过程必将发挥越来越重要的作用。