小鼠睾丸组织中转录因子Elk1 cDNA的克隆

廖梅坚 余裕强 朱良杰 孙家振 朱波 张学明

·实验研究·

小鼠睾丸组织中转录因子Elk1 cDNA的克隆

廖梅坚 余裕强 朱良杰 孙家振 朱波 张学明

为了确定Ets家族转录因子Elk1在睾丸组织中有无表达，提取了正常小鼠睾丸组织的总RNA，经RT-PCR、序列测定证实Elk1在正常小鼠睾丸组织中有表达，为进一步探讨其与睾丸发育及精子发生的关系奠定了基础。

Elk1转录因子;睾丸;小鼠

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)微环境的转录调控需Ets相关分子(Ets related molecule，ERM)参与［1，2］。ERM是Ets转录因子家族的成员之一，该家族至少包括11个亚家族、26个因子，广泛参与多种细胞的发育、分化、生长、转化等过程［3］。目前还不知道该家族其他分子在睾丸组织中是否表达。本研究旨在通过RT-PCR获得该家族转录因子Elk1基因的部分编码区，并对其序列进行分析，以确定其在正常睾丸组织中有无表达，为进一步探讨其与睾丸发育及精子发生的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、材料 7～8周龄、体重30～35 g的成年雄性昆明白小鼠4只，颈椎脱臼法处死后取睾丸放入液氮，后移入-70°C冰箱保存。大肠杆菌DH5α株为本室保存，克隆载体pMD18-T、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、反转录酶、RNase、Olig-dT、RNase抑制剂均购自于Takara。DL2000、质粒提取试剂盒、DNA片段凝胶回收试剂盒均购自于北京Tiangen。Trizol试剂购自Invitrogen，焦磷酸二乙酯(DEPC)、琼脂糖均购自Sigma，其他常用试剂购自于长春宝泰克。

1.2 引物设计［4，5］根据GenBank发表的Elk1的全序列设计合成特异性引物。Elk1的上、下游引物分别为:5'-CCTGAACTCTCCAGTTAGCC-3'，5'-CG TCTCCTACTTCAATGGTG-3'扩增片段大小为191bp。

1.3 睾丸组织总RNA的提取及RT-PCR［4，5］参照试剂盒说明，采用Trizol一步法提取睾丸组织总RNA，电泳检测其完整性。采用常规方法进行反转录PCR反应，反应条件为:94° C预变性5 min，94°C变性30 s，退火30 s(Elk1的退火温度分别为58.2)，72°C延伸1 min，72°C扩增10 min，循环数均为35个。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，在紫外灯下观察结果并拍照。采用DNA片段凝胶回收试剂盒按说明回收PCR产物。

1.5 克隆载体构建及测序［4，5］将PCR产物与pMD18-T载体4℃下连接过夜，构建重组质粒pMD-Elk1，经转化、筛选、质粒提取、PCR鉴定后，将阳性菌液制成甘油菌，送北京英俊公司测序。

2 结果

2.1 睾丸组织总RNA提取及Elk1的PCR扩增 将提取的总RNA凝胶电泳后在紫外灯下观察，可以见到2条清晰的电泳条带，分别为28S和18S，说明RNA提取成功，无降解。Elk1的RT-PCR扩增产物凝胶电泳后在紫外灯下观察到一条大小在100-250bp间的清晰条带，与预期目的带大小191bp相符。

2.3 Elk1的序列测定 测序结果显示，所获Elk1 cDNA完全正确。表明本实验正确克隆了Elk1基因，与预期结果相符。

3 讨论

Trizol一步法提取RNA避免了传统提取方法的繁琐过程和质量不理想等问题。为获得高质量的RNA，提取中所有用具均需RNA酶抑制剂DEPC处理，玻璃器皿180℃干烤8 h以上，提取前无菌操作间紫外照射2 h以上。操作中经常更换手套，防止皮肤上带有的RNA酶降解组织中的RNA。此外，还要注意内源性RNA酶所造成的RNA降解。处死小鼠后应迅速取睾丸并立即放入液氮。为保证RNA的提取率，同时也有利于下一步的RNA纯化，取材量要大。加入Trizol后的反应时间适当延长，从而保证组织充分裂解。加大氯仿用量和延长反应时间，离心后只取上层清液，这样从睾丸组织中提取的总RNA回收率很高，质量也较为理想。有了高质量的总RNA，采用常规RT-PCR即可获得目的基因cDNA，从电泳结果及序列分析结果看，所获片段大小及核酸序列与预期完全一致。本结果为下一步利用荧光定量PCR、原位杂交等方法深入分析Elk1的表达量及准确部位，揭示其与睾丸发育、精子发生等的关系奠定了基础。

［1］Chen C，Ouyang W，Grigura V，Hassell JA，Chandrashekar V，Hofmann MC，et al.ERM is required for transcriptional control of the spermatogonial stem cell niche. Nature， 2005，436: 1030-1034.

［2］Schlesser HN，Simon L，Hofmann MC，Murphy KM，Murphy T，Hess RA，et al.Effects of PEA3(ets variant gene 5)on testis and body growth，time course of spermatogonial stem cell loss，and fertility in mice.Biol Reprod，2008，78:483-489.

［3］Gutierrez-Hartmann A，Duval DL，Bradford AP.ETS transcription factors in endocrine Systems.Trends Endocrinol Metab，2007，18 (4):150-158.

［4］F奥斯伯，R布伦特，RE金斯顿，等.精编分子生物学实验指南.严子颖，王海林，译.北京:科学出版社，1998.

［5］J萨姆布鲁克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第二版.金冬雁，黎孟枫，译.北京:科学出版社，1995.

国家自然科学基金(项目编号:30771555);吉林大学及吉林大学农学部大学生科技创新计划项目(项目编号:2010B81157，200981SA14)

130062吉林大学畜牧兽医学院

张学明