无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用

王 烨 顾兴芳

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

随着人们生活水平的提高，蔬菜、花卉类园艺作物在日常消费中的比重越来越大，人们对于园艺产品的要求也越来越高，但在短期内传统的育种手段很难有新的突破，研究人员期望通过更先进的技术如转基因技术对育种材料进行创新和改良。但目前绝大多数蔬菜作物的转基因研究尚停留在实验室水平，还未真正走向市场。这不仅与转化效率较低有关，更与转基因作物的安全性相关。

1 采用无抗性选择标记转基因技术的意义

从 1983年获得第一株转基因烟草以来，植物转基因技术已经有了很大发展，所涉及的作物种类也越来越多。截止到2009年，有23个国家已经批准基因改造作物的商业化种植，并且有29个国家允许基因改造作物进口或将其释放到自然环境中去（Koreen et al.，2009）。随着转基因作物新品种的问世及其商品化的不断扩大，人们对于转基因技术在食品安全和生态环境安全的关注也日渐增多，并影响到其应用和商业化进程。目前所采用的转基因技术一般采用抗性选择标记（如抗生素类或除草剂类抗性基因等）对转化植株进行筛选。筛选结束后选择基因同目的基因一并整合到植物基因组中，其继续表达的产物可能会对作物生长、生态环境甚至人类带来一系列不安全因素。主要表现在对食品、药品的安全影响。当抗性选择标记基因是编码一些动物肠道抗生素类的抗性物时，这些基因可能被转移到微生物中去，这样就增强了病原微生物的抗药性，引发药物的减效或失效。另一方面转基因作物可能会影响到生态环境安全，如对抗除草剂基因的使用。如果发生以花粉为媒介的基因漂流，可能使某些杂草获得对除草剂的抗性而成为无法杀死的“超级杂草”（Pavletich & Pabo，1991），然而目前还没有关于标记基因漂移带来危害的报道（Puchta，2003）。为了规避具有潜在危险的抗性标记基因可能引发的安全问题，研究者力图避免使用抗性基因，最早是在马铃薯的转化中采用致病性强的农杆菌进行侵染，不采用标记基因而是对再生植株进行筛选，PCR检测转化率仅1 %～5 %。该方法的缺点是工作量大且阳性率低（de Vetten et al.，2003；Ahmand et al.，2008），优点是转化植株无需进行抗性标记基因的剔除（Goldbrough et al.，1993；张余洋 等，2004）。现在更多研究者致力于采用安全选择标记基因或者标记基因删除法来改进转基因技术。总之，培育无抗性选择标记基因的转基因植物是当前植物基因工程研究迫切需要解决的课题。

2 无抗性选择标记转基因技术

2.1 安全选择标记基因的应用

在转基因过程中利用安全选择标记基因，利用这些基因编码的蛋白使转化细胞可以继续生长，从而在代谢和生长过程中处于优势，非转化细胞则会衰亡；或者是借助某个基因编码蛋白的表达来改变植株原有的状态，使转化植株较容易被识别出来。

2.1.1 与糖代谢相关的基因 磷酸甘露糖异构酶基因（phospho mannoseisomerase gene，pmi）编码的甘露糖磷酸异构酶可以催化 6-磷酸甘露糖转化为 6-磷酸果糖。培养基中的甘露糖被植物吸收后，经细胞内的己糖激酶催化为 6-磷酸甘露糖，转化有 pmi的细胞可以将 6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，继而为植物利用，在转化过程中累计的ATP也可以为细胞生长提供能量（Weisser et al.，1996）。pmi是个源于植物自身的基因，且甘露糖更是作为甜味剂在食品加工业中广为应用，是目前发展较完善的一个安全标记。Joersbo等（1998）早在甜菜上尝试以甘露糖为选择压，效率比以Kam为选择标记高1倍。

在红色链霉菌（Haldrup et al.，1998a）和高温厌氧芽孢杆菌（Haldrup et al.，1998b）中都有一个木糖异构酶基因（xylose isomerase gene，xylA），编码木糖异构酶，催化D-木糖和D-木酮糖之间发生互变异构。很多植物无法利用D-木糖，因此在含有D-木糖的选择培养基上，转化xylA的细胞可以将D-木糖转化为可利用的D-木酮糖，而那些非转化细胞则会因为缺乏碳源而生长受到抑制。该选择基因较早被应用到马铃薯上，用xylA作为选择标记基因的转化频率是用Kam选择的10倍（Haldrup et al.，1998a），且木糖是人类食品加工业中常用的添加剂，因此用木糖作为转化选择标记是安全的（Jaiwal et al.，2002）。

一般的植物细胞不能利用核糖醇为碳源，但大肠杆菌 C菌株可以在两个紧密串联的操纵子atl/rtl的协助下在以核糖醇为碳源的培养基上生长，因为它们编码的蛋白酶分解代谢核糖醇，以其为选择标记在培养基中添加核糖醇就可以筛选出转化植株（Lafayette et al.，2001）。Reiner等（1975）把atl/rtl从C菌株分别转化到K-12菌株和B菌株中后，两个菌株都可以在以核糖醇为碳源的培养基上继续正常生长（Reiner et al.，1975）。但目前未见在植物上成功利用的报道。此外，2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐磷酸酯酶基因（DOGR1）（Kunze et al.，2001）和阿拉伯脱氢酶基因（atlD）（Lafayette et al.，2005）也属于糖类相关选择基因，但对其应用不多。

2.1.2 与激素相关的基因 植物基因组内有很多调节激素代谢的相关基因，这些来源于植物自身的基因同样可以作为转基因的选择标记基因，而且非常安全。GUS基因来源于大肠杆菌，编码β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）。GUS常作为报告基因，但Joersbo和Okkels（1996）利用GUS为选择标记基因对植物细胞进行筛选，效率是用Kam选择的2.9倍。Okkels等（1997）发现其原理是转化细胞中的GUS基因可以作用于选择培养基中添加的葡萄糖苷酸，从而释放出有活性的细胞分裂素来促进细胞的分化、生长，而未转化细胞则会分化受阻。

ipt主要源于农杆菌 T-DNA，其编码的异戊稀基转移酶可以催化细胞分裂素合成的第一步，而细胞分裂素可以促进芽点分化。利用这个标记获得的转化植株由于激素代谢相关酶的超量表达使细胞分裂素的水平提高，植株的生长点失去顶端优势，表现出叶片卷曲、节间缩短，以此来鉴别转化植株，但最后必须再利用转座子元件（Ebinuma et al.，1997）或重组酶（Sugita et al.，1999）来删除ipt。这一方法已经在烟草（Ebinuma et al.，1997；Kunkel et al.，1999；Sugita et al.，2000）上获得验证。此外，源于根癌农杆菌NIAES1724的rolA、rolB和rolC也可通过提高生长素活性来诱导“发状根”，以此作为选择标记（薛健 等，2008）。

吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH可以编码调节植物吲哚乙酸代谢过程中的关键酶，使转化细胞和非转化细胞在激素代谢上造成差异（Ebinuma & Komanine，2001），从而达到选择的目的，但对其在植物遗传转化中的应用却较少报道。

2.1.3 与氨基酸代谢相关的基因 高等植物中赖氨酸是通过天冬氨酸途径合成的，同时伴随异亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的合成。此合成途径的关键酶是天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶羧酸合成酶（DHDPS），AK受赖氨酸和苏氨酸的抑制，而DHDPS则严格受赖氨酸的反馈调控（Mills et al.，1980）。但在细菌的赖氨酸合成途径中，AK和 DHDPS对赖氨酸的反馈调节不敏感。因此在赖氨酸和苏氨酸的选择培养基上转化了ak的再生植株可以保持较高水平的AK活性，保证了生长需要的氨基酸，而非转化细胞则因为氨基酸合成途径受阻而死亡（Jaiwal et al.，2002）。Perl等（1993）克隆了大肠杆菌中对赖氨酸反馈抑制不敏感的lysC，将其转化马铃薯。Brinch-Pedersen等（1999）也用赖氨酸和苏氨酸为选择压，研究转化大麦，但出现较多白化苗。与氨基酸代谢相关的基因作为标记的还有邻氨基苯甲酸合成酶基因ASAL（Makiko et al.，2005）和乙酰乳酸合成酶基因mALS（Tougou et al.，2009），但都没有应用到蔬菜作物上。

2.1.4 其他安全选择标记基因 从维多利亚水母体内发现并分离出的绿色荧光蛋白基因（GFP）不仅可以在原核生物细胞中表达，还可以在真核生物细胞中表达，而且不会影响转化细胞的正常生长和功能，其优势还在于不需要添加任何辅助因子而只需对其外观进行荧光检测就可以加以辨别（Stuber et al.，1998）。GFP在植物遗传转化中常作为报告基因，但目前越来越多的研究将其作为选择标记基因，并已经应用在烟草（朱生伟 等，2003）、水稻（Chung et al.，2000）、甜菜（Zhang et al.，2001）和甘薯（Lawton et al.，2000）等作物的遗传转化上。

甜菜碱脱氢酶基因BADH也常作为一个安全选择标记应用到植物遗传转化中。BADH源于藜科高等植物，其编码的蛋白可以催化有毒的甜菜碱醛转化为无毒的甜菜碱，即在选择培养基中添加甜菜碱醛作为选择压就能筛选出转化植株。Danielle等（2001）以BADH作为选择标记转化烟草叶绿体基因组，转化效率是用壮观霉素选择的25倍。

甜椒类铁氧还蛋白基因PFLP曾用于兰花的遗传转化。You等（2003）将PFLP的cDNA构建在CaMV35S启动子下，对兰花进行基因枪和农杆菌转化，以对胡萝卜软腐欧文氏菌的抗性为标记，最终获得了转基因兰花植株。

谷氨酸-1-半醛-转氨酶基因hemL编码谷氨酸-1-半醛转氨酶，其活性会影响叶绿素的合成。在选择培养基中添加3-氨基-2，3-二氢苯甲酸就能抑制谷氨酸-1-半醛转氨酶的活性，就无法正常形成叶绿素（Allison et al.，1997）。从Synechococcus PCC6301中分离得到抗3-氨基-2，3-二氢苯甲酸突变体GR6，其编码基因hemL 在第5、6、7位发生丝氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸的删除，248位蛋氨酸取代异亮氨酸。将此基因转化植物可以提高细胞对3-氨基-2，3-二氢苯甲酸的抗性。整合有hemL的转化植株可以在含3-氨基-2，3-二氢苯甲酸的培养基上保持绿色，非转化植株则会白化（Gough et al.，2001）。

OsDREB2A和SOS1是分别从水稻和拟南芥中发现的两个抗盐基因。Zhu和Wu（2008）分别以这两个基因作为选择标记，构建载体 pZWOsDREB2A-cyc和 pZWAtSOS1-cyc，在含 200 mmol·L-1NaCl的培养基上对水稻进行转化并筛选。通过盐筛选系统的选择很安全，不仅能获得转基因植株，还可以获得耐盐胁迫的新材料。

2.2 标记基因删除法

该方法主要是利用常规的抗性选择标记筛选出转基因植株，然后通过转基因后代遗传重组使选择标记和目的基因分离，或者是利用位点特异性酶将选择基因剔除而获得无抗性选择标记的转基因植株。常见有共转化、转座子、同源重组和位点特异性重组。该方法尚处于开发阶段，试验对象也仅是烟草、拟南芥等模式植物。

2.2.1 共转化 共转化是将标记基因和目的基因分别构建在不同的载体上或者同一载体的不同T-DNA区域内，共同转化受体细胞后通过分子鉴定获得共整合植株，后代经遗传重组使标记基因和目的基因分离，并选择只含有目的基因的转化植株。共转化需要后代遗传分离来剔除标记基因，因而适合有性繁殖的植物，但DNA直接转移获得T-DNA容易紧密连锁（Ebinuma et al.，2001b），后代分离也较难获得标记基因分离的植株。具体有 3种途径：① 用双菌株转化，每个菌株含有一个不同的质粒。de Neve等（1997）将分别含有NPTⅡ和hpt的两个根癌农杆菌菌株混合后侵染拟南芥，其中southern-blot验证有44.4 %的转化植株有T-DNA连锁，证明了这一途径的可行性。Mc Knight等（1987）在烟草的转化中也采用了两个分别带有不同基因的农杆菌菌株。② 用单菌株转化，菌株含有2个不同的质粒。这种方法较容易分离获得只含目的基因的转化植株，但因为1个菌株内含有不同质粒容易引发质粒的不相容性，因此要注意质粒的选择问题（Daley et al.，1998）。③ 双 T-DNA法，即将2个基因整合到同一个质粒上，这一方法较混合菌株的方法转化效率高。Komari等（1996）将标记基因NPTⅡ或hpt分别和目的基因GUS构建在双元质粒载体的2个相邻T-DNA区域上，对水稻进行侵染，共转化率为47 %。分离后代中有65 %含有GUS，说明至少一半以上的共转化植株中双T-DNA的整合位点不连锁。Lu等（2001）改进了质粒的构建方法，把2个独立的T-DNA序列改建为含双右边界的T-DNA和一个左边界的T-DNA序列，用来转化水稻。

2.2.2 转座子 在玉米中首先发现的转座子也可以实现基因重组，如玉米的Ac/Ds转座原件，Ac主要是编码转座酶用于Ac和Ds基因的转座，Ds两端各有一个长度为数百个核苷酸的序列，中间可以插入较大的基因片段，且插入其他基因片段后的 Ds仍然可以同 Ac一起被转座酶转移（Fedoroff，1989）。基于这些特性，可以把目的基因置于转座子的外部同时将标记基因插入 Ds内部，转化植物后选择标记可以通过转座作用被转走，而转化后代经过遗传分离可以获得无标记的转化植株；也可以将目的基因插入 Ds内部，转座酶把目的基因转到染色体组的新位置上后再通过遗传分离获得无标记的转化植株。转座子法已经应用到了烟草、番茄和水稻上，并获得了无标记的转基因植株（Goldbrough et al.，1993；Sugita et al.，1999；Cotsaftis et al.，2002；金维正 等，2003）。其缺点是转座后基因还会重新插入，后代经过有性分离才能获得无标记植株，因此效率低，且工作量大、周期长，较适宜有性繁殖且生长周期短的植物。

2.2.3 同源重组 同源重组发生在DNA同源序列之间，指同源序列通过链置换和单链侵入形成异源双链，通过一些重组酶修复可使两条异源双链发生交换。将其引入遗传转化，即在用农杆菌转化获得选择标记的转基因植株后再设计一段同源序列，将标记基因置于2个同源序列之间，通过DNA重组将含有标记基因的DNA序列剔除。Fischer等（1996）曾用此方法转化烟草的叶绿体染色体组，最终获得了无标记基因转化植株。同源重组转化法不需要辅助因子参与，也无需后代的遗传分离过程，但在植物的真核基因组中的重组效率较低，报道甚少。

2.2.4 位点特异性重组 位点特异性重组是指通过重组酶在DNA特异位点间实现交换，需要重组酶和其识别位点。应用在转基因技术中，是在标记基因的两端分别插入重组酶的识别序列，在重组酶的作用下将标记基因删除。常见的重组系统有Cre/LoxP、FLP/FRT、R/Rs、Gin/gix和attP。

2.2.4.1 Cre/LoxP系统 Cre/LoxP系统是Sterberg在大肠杆菌噬菌体P1中发现的，由重组酶Cre和识别位点LoxP组成。Cre可以识别34 bp的部分回文的LoxP序列，无需能量和其他蛋白便可以在体内外对线性和环状甚至超螺旋结构的DNA分子进行重组（Ow & Medberry，1995）。重组酶可以通过二次基因转化将重组酶导入转基因植株，也可以通过与含有重组酶基因的植株杂交导入，在切除标记基因后，通过转化植株后代的分离将重组酶基因剔除，从而获得无标记基因的转基因植株。比较理想的是诱导表达系统与位点特异性重组系统相结合，将目的基因、标记基因和重组酶基因及其识别序列构建在一个载体上，诱导型启动子在目的基因引入后瞬间表达重组酶基因，删除标记基因和重组酶基因（Zuo et al.，2001）。Zuo等（2000，2001）构建了一个化学诱导表达的位点转移DNA删除系统PX6-GFP，培养基中的β-雌二醇诱导XVE表达，启动Cre重组酶基因表达将识别序列间的选择标记基因删除。Hoff利用Cre/LoxP构建了pCrox载体，利用热激启动子HSP81-1启动Cre，以GUS为报告基因（Hoff et al.，2001）。高尚等（2007）构建了NPTⅡ基因可被删除的和可插入目的基因的通用植物表达载体pBI121-lox-MCS。这些表达载体可广泛用于培育无选择标记的转基因植物。

2.2.4.2 FLP/FRT系统 酿酒酵母2μ的环状质粒中发现的 FLP特异性位点重组酶是首先被用于切除转基因植物中的标记基因的，因此 FLP/FRT是最早创建的位点特异性重组系统。Cregg和Madden（1989）克隆了酵母的FRTs之间的Arg，将FRTs-ARG+-FRTs结构导入Arg-酵母中，筛选得到了Arg+转化植株。而后二次导入FLP重组酶，又获得了Arg-的转化子，证明发生了重组。后来Lyznik等（1993）又将该系统应用于玉米和水稻的原生质体转化。单晓昳等（2006）利用多步重组，构建了可在植物中广泛应用的FLP/FTR位点特异性重组系统，经过热激处理后41 %的二次转化植株发生了标记基因的删除。目前所报道的植物转基因研究中对该系统利用时均采用了二次转化。

2.2.4.3 R/Rs系统 在结合酵母的环形质粒pSR1中发现了这一系统（Sugita et al.，1999），包括重组酶R和2个重组酶识别位点Rs，在重组酶R的作用下识别位点Rs间发生同源重组（Reiner，1975）。Onouchi等（1995）利用含有R重组酶基因的转化植株与位于Rs位点间的插入标记基因的植株进行杂交，获得了无选择标记的拟南芥。Sugita等（2000）把诱导表达系统和MAT载体结合，将R基因构建在除草剂“safener”诱导表达的启动子之后，两侧有重复序列Rs，获得了14 %含有GUS的无选择标记植株，其中多数为单拷贝整合。

2.2.4.4 Gin/gix系统和attP系统 Gin/gix系统是在Mu噬菌体中被发现的，在重组酶Gin的作用下，两个特异性识别位点gix间的DNA片段发生剔除（Maeser & Kahmann，1991）。attP系统则是利用了噬菌体能通过噬菌体附着位点（attP）整合到大肠杆菌基因组的细菌附着位点（attP）上的原理。Zubko等（2000）发现在噬菌体的2个attP位点之间发生了染色体内同源重组而将标记基因剔除，且不含INT和IHF蛋白的转化体系。这两个系统尚处于待开发和利用的阶段，虽然在噬菌体上得以证实但在高等植物的遗传转化中缺少应用。

3 无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用

无抗性选择标记转基因技术是目前转基因技术的前沿，在粮食作物和经济作物上已经展开较深入的研究，但在转基因技术相对薄弱的园艺作物上应用却非常有限。

与糖类相关的选择基因中利用pmi作为选择标记的研究较多。彭世清和陈守才（2005）在番茄的遗传转化中尝试建立甘露糖阳性选择系统，构建了pmi为选择标记的植物表达质粒载体pPMI并导入农杆菌EHA105中，研究甘露糖对番茄生长和生根的影响及叶盘对甘露糖的敏感性。通过农杆菌介导番茄，获得了转化的再生植株，表明以甘露糖为阳性选择系统在番茄遗传转化中的应用是可行的。王达新（2007）以黄灯笼椒为材料，建立高效的离体再生体系，利用 pBI121和pNOV2819及CMVcp基因构建了以pmi为选择标记的pNOVcp植物表达载体，并通过其对甘露糖的抗性选择试验建立起甘露糖阳性筛选遗传转化体系。同年，Min等（2007）将pmi作为选择标记基因，试图将GLO和JMT两基因转入大白菜，通过在培养基中添加7 g·L-1的甘露糖和2 %的蔗糖对再生植株进行筛选，初步建立了甘露糖阳性选择系统，两基因的转化率分别为 1.4 %和3.0 %，从而为大白菜转基因研究提供了一条新的途径。王洪伟（2009）曾通过携带含有pmi质粒的农杆菌LBA4404侵染番茄子叶外植体，利用甘露糖筛选系统进行筛选，共获得了54株再生植株，PCR初步证明获得了阳性转scFv植株。张海（2009）通过建立含pmi选择标记的pCAOxOPMI表达载体导入甘蓝型油菜，共获得甘露糖抗性植株14株，PCR检测其中11株为阳性。对木糖异构酶基因的利用，Haldrup等（1998b）曾将xylA作为选择标记的木糖筛选体系应用到番茄的遗传转化中，较理想的筛选浓度是15 g·L-1的D-木糖，并获得了初步成功，转化率可以达到9%，而用Kam选择的转化率仅有7 %。崔丽巍（2010）以大肠杆菌xylA作为选择标记基因，利用木糖作为选择剂获得能够表达带有GUS报告基因的转基因黄瓜。同时构建了pX390-scFv载体，以木糖作为筛选剂进行黄瓜遗传转化研究，初步建立了农杆菌介导的基于木糖选择系统的黄瓜转化体系。

以植物激素相关基因 ipt为选择标记在园艺作物的遗传转化上也有成功的报道。Kunkel等（1999）利用地塞米松（dexamethasone）诱导的启动子使 ipt表达，在诱导条件下获得了莴苣的转化植株。Thirukkumaran等（2009）也将该法用于长寿花的遗传转化，通过PCR验证超过90 %的正常芽为ipt和GUS阴性，这些结果表明ipt引起的丛生芽现象可以将非转化苗明确区分。

在删除选择标记策略中，共转化法在园艺作物上的研究较多。Goldbrough等（1993）利用转座子法把标记基因GUS作为报告基因插入Ds内部，通过转化后代的遗传分离最终获得了无标记基因的转基因番茄植株。张余洋（2006）将位点特异性重组Cre/LoxP化学诱导系统应用到番茄的遗传转化研究中，p35G植物载体转化番茄后共得到19个抗性芽，经过β-雌二醇诱导后有2个无抗性标记的再生芽可以观测到绿色荧光蛋白的表达，证明该诱导自主剔除系统适用于番茄。

4 小结与展望

目前，研究人员致力于各种安全标记开发和无选择标记的转基因技术的研究，主要是为了降低或克服转基因植物的安全性问题，避免转基因植物可能给自然环境带来的负面影响，同时减少社会对于转基因产品的顾虑，为其商业化铺平道路。尽管这些新方法有着各种各样的优势和缺陷，但都证明转基因技术在日益完善。新技术已经在很大程度上解决了传统方法利用抗性选择标记对生态环境和食品、药物安全方面影响的问题，更省去了对抗性标记的安全性评估的过程。上述无抗性标记转基因技术中，pmi、xylA和gpf等安全标记已经广为应用到植物的遗传转化研究中；共转化法则是目前研究较深入且适用面较广的无抗性标记转基因方法；位点特异性重组法虽然现在尚处于研发阶段，但将来应该是转基因技术的重要发展方向之一。尽管这些新方法的研究已取得了一些成果，但只是在拟南芥、烟草和马铃薯上获得了较大的进展，其他植物尤其是转化效率较低的作物首先需要提高转化效率。

转基因技术的研发及其商业化在粮食作物和经济作物上已经取得了一些成果和进展，例如水稻、玉米、大豆和烟草。但在蔬菜作物上受到的阻力较大，科研方面取得的研究进展就更少。为了发挥转基因技术的优势，规避缺陷，发展出效率更高、更安全、更易操作的转化方法，培育无抗性选择标记的转基因植物将是转基因领域发展的必然趋势。

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