免疫毒素构建的研究进展

刘树雷 何 威 王儒鹏 (新桥医院皮肤科,重庆400037)

免疫毒素(Immunotoxins,Its)作为肿瘤靶向治疗的策略之一,是将具有导向能力的载体与具有细胞毒性的分子组合而成的具有特异性杀伤能力的杂合分子,被称为“生物导弹”[1]。因此,在构建免疫毒素时,既要寻找具有细胞选择性的定向“载体”,又要筛选高效的毒素“弹头”。目前研究认为,免疫毒素杀伤肿瘤细胞主要通过以下两种方式[2]:一是通过与细胞表面受体结合,进入胞内抑制蛋白质合成而发挥作用;二是毒素蛋白直接作用于细胞膜,使得细胞内容物泄漏,终致细胞死亡。本文主要从作用靶点的选择,弹头与载体的设计以及两者的连接方法等几个方面综述免疫毒素构建的研究进展。

1 免疫毒素作用靶点的选择

免疫毒素研究最大的障碍是缺少特异性分子标志。目前,已知的肿瘤分子标志物还没有仅表达于肿瘤细胞而不表达于正常细胞。因此,寻找合适的作用靶点是免疫毒素构建的关键。目前,对免疫毒素作用靶点研究最多的主要有以下四类受体。

1.1 神经肽受体 目前发现,神经肽受体主要过度表达于肿瘤细胞表面[3]。选择神经肽受体作为免疫毒素治疗靶点有以下优点[4]:该受体在多种肿瘤细胞表面表达增强,而在其他正常组织表达百分比较少;另外,与此类受体结合的配体目前已发现的较多。所有神经肽受体可以作为肿瘤治疗靶点的主要有四类[4]:①蛙皮素受体-2,主要表达于肺癌、乳腺癌、结肠和直肠癌;②血管活性肠肽(VIP)受体-1,主要表达于肺癌和乳腺癌;③神经加压素受体,主要表达于胰腺癌;④胃泌素受体(Gastrin receptor),主要表达于胰腺癌。所有神经肽受体都是G蛋白偶联受体(GPCR),其信号传导通路已被研究清楚,从而有利于制备出针对此类靶点的导向治疗药物。

1.2 表皮生长因子受体 表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)属于糖蛋白,相对分子质量170 kD,是一条含有1 186个氨基酸残基的多肽链,由细胞外结构域、跨膜区和细胞质结构域三部分组成[3]。EGFR在肿瘤的发生及发展中起重要作用。对乳腺、卵巢、膀胱、结肠、食道、宫颈、前列腺、肺及头颈部肿瘤的研究表明,EGFR表达与上述脏器肿瘤患者的生存时间缩短有密切关系。由于表达于多种肿瘤细胞表面且易于被免疫毒素识别,EGFR被认为可以作为肿瘤导向治疗的有效靶点,已有许多研究者制备出针对该受体的免疫毒素,有的已进入Ⅱ期临床试验[3]。

1.3 CD105 CD105是一种以同源二聚体形式存在的细胞膜糖蛋白,可通过调节转化生长因子-β(TGF-β)受体复合物而影响细胞对 TGF-β的反应[5]。CD105是新生血管的标志,有血管生成的各种组织以及肿瘤组织边缘的血管内皮细胞高表达CD105。与正常组织相比,CD105在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和子宫颈癌等多种肿瘤组织内皮细胞的表达均明显上调。CD105的表达还可以作为乳腺癌转移和愈后不良的标志。新血管生成是实体肿瘤普遍存在的特征,与肿瘤的浸润及转移密切相关。免疫毒素通过与CD105接合可特异性杀伤新生血管内皮细胞,切断肿瘤生长所需要营养物质的供给,从而抑制肿瘤生长。在动物模型中已证实,放射性核素标记的抗CD105单克隆抗体可以有效地进入肿瘤组织,提示CD105可以作为肿瘤导向治疗的有效靶点[6]。

1.4 肿瘤特异性抗原 肿瘤的发生、发展和演变过程也赋予了肿瘤抗原许多自身特点,如可以使肿瘤细胞表面某种抗原表达增强等。p230表达在人黑色素瘤、肝癌和乳腺癌细胞表面的糖蛋白,以黑素瘤细胞表达水平最高。因此,对于黑色素瘤而言,p230具有很强的肿瘤特异性。利用能与抗原p230特意性结合的单克隆抗体SM5-1对401例黑色素瘤临床标本(250例原位黑素瘤和151例转移性黑素瘤)进行筛查发现,p230在98%的黑素瘤组织标本中表达,而正常组织中除在汗腺有少量表达外,其余正常组织均不表达p230[7]。Lewis-Y抗原主要表达于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肺癌,以Lewis-Y抗体为载体的免疫毒素目前已进入Ⅰ期临床试验[7]。

2 毒素分子的类型和作用特点

2.1 植物来源的毒素 植物来源的毒素是一种核糖体失活蛋白(Ribosome inactivating protein,RIP),主要分为两型:①Ⅰ型RIP是具有酶活性的一条肽链,分子量通常为25～32 kD,由于它没有和细胞结合的能力,因此,这类毒素对完整的细胞难以施加其毒性,而对无细胞系统中的蛋白质生物合成表现出较强的抑制活性。该类毒素主要包括丝瓜素蛋白(Luffin)、天花粉蛋白(Trichosanthin)、美洲商陆抗病毒蛋白(Phytolacca antiviral protein,PAP)、皂草蛋白(Saporin)、康乃馨蛋白(Dianthin)和多花白树素(Gelonin)等[8,9]。Li等[9]从 Luffin中又分离出一种目前分子量最小(5.2 kD)的RIP—Luffin P1,其IC50为0.88 nmol/L。Luffin P1以聚合物的形式存在,这样可增强其RNA N-糖苷酶活性。由于其分子量小、抗原性弱,易被载体携带进入肿瘤细胞内,因此,Luffin P1是目前制备免疫毒素弹头较理想的RIP。②Ⅱ型RIP为分子量在60～65 kD之间的糖蛋白,通过二硫键连接的α与β两条肽链组成,其中α链有核糖体失活蛋白酶活性,β链有与细胞膜上半乳糖残基结合的能力。此类毒素主要包括蓖麻毒素(Ricin)、相思子毒素(Abrin)等[9]。

虽然两型RIP的来源和结构不同,但作用机制都十分相似。Ⅰ型或Ⅱ型RIP的α链通常具有N-糖苷酶的活性,它们直接作用于核糖体,灭活其60S大亚基,具有很强的抑制蛋白质合成的活性。Ⅰ型和Ⅱ型RIP对无细胞体系中蛋白质生物合成的作用效果相似,Ⅰ型 RIP的 IC50在 0.03～4 nmol/L之间,Ⅱ型RIP的IC50在0.1～80 nmol/L之间,而对于细胞的毒性却不同,Ⅰ型RIP的 IC50在 200～9 000 nmol/L之间,而Ⅱ型 RIP的 IC50在0.001～0.5 nmol/L之间,Ⅱ型RIP比Ⅰ型RIP要高出106倍。二者对细胞毒性不同的原因在于Ⅱ型RIP的β链具有凝集素功能,能够介导其α链进入细胞[10]。

2.2 细菌来源的毒素 经典的细菌毒素主要有白喉毒素(Diphtheria toxin,DT)、甲绿单胞菌外毒素(Pseudomonasexo toxin,PE)、霍乱毒素(Cholera toxin,CT)、大肠杆菌热不稳定性毒素(Ecoli heat-labile toxin)、志贺氏毒素(Shiga toxin)、百日咳毒素(Pertussis toxin)等,不同细菌毒素的结构存在一定的差异。DT和PE都是单一的肽链(分子量60～70 kD),其分子中含有于细胞结合区(相当于植物毒素的β链)和酶活性区。其中PE分子中还含有帮助其转位进入细胞浆的转位区[11]。霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定性毒素的分子结构相似,都由1条α链(分子量约30 kD)和5条β链(β链分子量为 11.5 kD)构成,通过非共价键相互作用而连接成五聚体。志贺氏毒素则由1条α链(分子量30 kD)和6或7条相似的β链(β链分子量5 kD)构成。百日咳毒素是已知毒素中结构最复杂的分子之一,由1条α链(分子量28 kD)和5条β链聚合连接,5条β链的大小不同,其中2条分子量为11.7 kD,其余 3条分别为 9.3、22和23 kD[12]。

大多数细菌毒素的作用位点主要为延长因子2(longation factor-2,EF-2)和腺苷酸环化酶。细胞在合成蛋白质的过程中,肽链的延长需要多种延长因子,但其中最为关键的是EF-2。白喉毒素和绿脓杆菌外毒素具有ADP-核糖转移酶活性,可以使EF-2发生糖基化,从而直接导致其失去功效。霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定性毒素和百日咳毒素主要作用于cAMP信号转导通路,它们的α亚基也有ADP-核糖转移酶活性,但其作用底物是细胞膜上的G蛋白,可引起G蛋白功能失调。理论上只要有一个毒素分子进入细胞即可导致细胞死亡,然而,异源性和分子量大是细菌来源毒素存在的最大问题,免疫原性高会引起机体产生免疫应答,分子量大使之对肿瘤细胞穿透性较差[13]。

2.3 真菌来源的毒素 真菌来源的毒素为数不多,主要是从不同霉菌中分离的 a-Sarcin、restrictocin(Res)和mitogillin(Mit)等几种蛋白毒素,这类毒素仅由一条分子量16～17 kD的多肽链组成,属于单链核糖体失活蛋白[14]。它们均有特异的核酸内切酶活性,可以催化水解28 S RNA 3′-端的单个磷酸酯键,导致核糖体60 S亚基失活,从而抑制细胞蛋白质合成,导致细胞死亡。

2.4 人源性蛋白毒素 人源性的蛋白毒素分子包括核糖核酸酶和补体等。人源性蛋白毒素在免疫毒素的构建过程中使用较少。这类毒素分子最主要特点是可以避免在人体内产生抗外源毒素的抗体,从而使免疫毒素的副作用减少[15]。以人表皮生长因子(hEGF)为载体及人胰核糖核酸酶为弹头构建的重组免疫毒素hEGF-hpRNase,在体外细胞毒实验中已显示对EGFR过度表达的上皮癌细胞有明显的特异性杀伤作用[15]。

3 免疫毒素载体类型

3.1 细胞因子载体 细胞因子与其细胞表面的受体结合可有效介导毒素的内吞。细胞因子受体水平受细胞活化和分化的调节,不同细胞亚群的细胞因子受体表达水平不同,细胞因子能选择特定的细胞群,因而可用细胞因子作为靶向载体。在许多肿瘤细胞表面存在大量细胞因子和生长因子受体[16],如人多发性骨髓瘤细胞和肝癌细胞表面存在大量IL-6受体;急性髓系白血病细胞表面存在丰富的高亲和力粒细胞-单核细胞系集落刺激因子受体;T细胞和部分B细胞相关的肿瘤高度表达CD25分子。CD25是IL-2受体(IL-2R)的α链,它与IL-2Rβ链与γ链一起构成高亲和力IL-2受体,在理论上就可通过低浓度的细胞因子IL-2融合蛋白选择性作用于活化的淋巴细胞。重组免疫毒素DAB-IL2和PE40-IL2就是以高亲和力的IL-2受体为作用靶点,作用于表达IL-2受体的皮肤T细胞淋巴瘤细胞,达到靶向杀伤的作用[16,17]。人肾癌细胞(RCC)表达大量高亲和力的IL-4受体(IL-4R)。人们设计了以IL-4为载体的免疫毒素,并对IL-4进行改造,使其IL-4的羧基和氨基端都融合一个GGNGG肽段,把PE38-KDEL融合在IL-4的37号位点。它比IL-4-PE38KDEL的细胞毒性高5～10倍,与RCC细胞的IL-4R亲和力高5～12倍[17]。目前常用的作为载体的细胞因子主要有 IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、TGF-α和表皮生长因子(EGF)等。

3.2 单克隆抗体 单克隆抗体具有和肿瘤细胞表面特异性抗原结合的能力,而被广泛用作免疫毒素的载体。单克隆抗体一般选用IgG分子,因为其它亚类的免疫球蛋白分子容易聚集,不宜纯化。完整的IgG分子量大,穿透性差,应用过程中受到一定限制,故近年来人们采用基因工程手段,制备出具有渗透性好、稳定性强的肿瘤细胞导向特异性的小分子抗体[18],常见的有单链抗体(scFv),其分子量较小(约25 kD),它是将单克隆抗体的轻链可变区片段(VL)与重链可变区片段(VH)由柔性连接肽连接而成。scFv保留了完整抗体的特异性和亲合力。许多scFv免疫毒素在抗血液肿瘤和实体瘤上已显示出良好的效果。为了进一步减小抗体分子量,人们又设计了仅含重链可变区(VH)的单域抗体,其分子量仅为单链抗体的一半,但保留了单链抗体大部分的抗原结合能力。不论是单链抗体还是单域抗体,所构建免疫毒素的半衰期都比较短,在体内容易被廓清。近年来,人们又开发了人源化抗体,目前研究较多的是各种基因工程抗体,其设计目的是尽量降低抗体在体内诱发的免疫排斥反应;其主要特点是既保持了抗体的亲和力,又不易引发免疫反应,而且在人体内的半衰期也较长。目前以单克隆抗体为载体的一些免疫毒素已经进入了Ⅰ、Ⅱ期临床试验[18]。

4 免疫毒素偶联方式

免疫毒素的制备除了要选择合适的靶向部分和毒性部分外,还应考虑到如何选择最恰当的方法来连接这两部分。

4.1 化学偶联法 化学偶联法最早用于单抗和药物分子之间的连接,后来用于免疫毒素的连接,即人们在载体和毒素分子之间引入异型双功能交联剂,可不影响载体和毒素分子的活性。目前应用的双功能交联剂有N-羟基琥珀酰亚胺、N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)、2-IT、MBS 、间苯甲酸酯 、S-乙酰巯基琥珀酸酐等,其中SPDP和MBS较为常用。SPDP是与蛋白质的伯氨基反应,在蛋白质上引入2-吡啶二硫化物基团,在二硫苏糖醇(DTT)的作用下暴露出SH基,再与另一连接了SPDP的蛋白反应,通过双硫键将两个蛋白连接在一起[19]。MBS是与蛋白质伯氨基反应,在蛋白质上引入一个稳定的化学基团,即马来酰亚胺基团,然后与另一含巯基键蛋白质反应,通过中间的马来酰亚胺基团将两个蛋白连接在一起[18],MBS连接后的融合蛋白比用SPDP连接的融合蛋白质稳定。免疫毒素的化学偶联法存在的主要问题是分子量大、免疫原性高、载体和毒素分子在体内容易分离。

4.2 基因工程融合法 基因工程融合法制备的重组免疫毒素,是用分子生物学技术将载体部分与毒性部分通过Linker进行基因串联[20]。通过PCR方法扩增目的基因片段,并对目的基因片段和载体进行双酶切,然后把目的基因片段连接到载体上,再将其克隆至表达质粒并转入表达菌如BL21(DE3)中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达。并经过蛋白的纯化、鉴定等方法,最后得到有活性的融合蛋白。近几年的研究发现,如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列,使外源蛋白进入细胞内产生后定向运输到细胞内的特定部位如内质网或液泡等,可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量。这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境,有效地防止了外源蛋白的降解。已有实验证实,在大肠杆菌中表达带有内质网滞留信号肽(KDEL)的ricin A-KDEL比不带KDEL结构的ricin A的细胞毒活性明显提高。基因工程融合法得到的融合蛋白有两种表达形式,一种是可溶性表达,这是蛋白比较理想的一种表达形式。另一种是包涵体表达。包涵体表达需经变性及复性过程,操作复杂,蛋白损失较大,活性降低,因而成为是基因工程融合蛋白纯化过程的重点和难点[20]。

5 存在的问题与展望

目前,构建的免疫毒素还存在以下几方面的问题[21]:①免疫毒素大多是由异源性的抗体为靶向载体,对机体来说是异种蛋白,容易在体内产生免疫反应,加速了免疫毒素的衰减,同时也增加了副作用;②免疫毒素的毒素部分分子量较大,对组织的穿透性差,对实体瘤的穿透力弱,容易被机体清除;③多数免疫毒素存在非特异毒性,与正常细胞及组织可非特异性结合,从而引起许多副作用,如血管渗漏综合征等。

针对免疫毒素存在的上述问题,可以通过以下途径使之改善[21]:①寻找靶细胞上特异性靶点,以及通过调节细胞表面靶点的表达促进免疫毒素的作用;②降低免疫毒素的抗原性,包括对决定载体及毒素分子免疫原性的部位进行定位突变或基因删除等修饰,选择小分子量的毒素,开发人源化的载体及毒素等;③选择恰当的连接子以提高载体和毒素分子的稳定性。

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