动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用

黄永震,贺 花,陈 宏

(西北农林科技大学动物科技学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西 杨凌 712100)

动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用

黄永震,贺 花,陈 宏＊

(西北农林科技大学动物科技学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西 杨凌 712100)

动物转基因技术已应用于生命科学的各个领域,尤其在研究基因功能、转基因动物育种(抗病育种和提高生产性能)、治疗人类疾病(生产药用蛋白、干细胞治疗和种器官移植)等方面得到了广泛的应用。本文从转基因技术的历史和发展状况入手,简要介绍了几种传统的转基因技术方法,重点综述了近几年为提高转基因效率和转基因精确调控的一些新技术。另外,本文就转基因技术在牛育种方面的研究现状,以及对转基因技术在牛新品种培育和生物制药等领域的应用和前景进行了综述。

动物转基因技术;转基因效率;转基因精确调控

转基因动物实验可追溯到1974年,Brackets等将兔的精子与SV40病毒DNA孵育后,进行体外受精获得转基因兔。同年,Jaenisch等将SV40病毒DNA注射到小鼠胚胎囊腔中,获得携带外源基因的嵌合体小鼠。1980年,Gordon等首次报道用原核注射获得了转基因小鼠。此后,世界各国相继开展转基因动物的研究。1982年,美国科学家Palmiter等将大鼠生长激素(GH)基因导入小鼠受精卵中获得转基因“超级鼠”,被认为是世界上首批转基因动物。直到1990年,美国Genzym e T ransgene公司才通过原核显微注射法获得了世界上第1头转基因牛。但由于牛本身具有产奶量大等独特优势,还是吸引了不少科学家对其进行研究,尤其是在 1997年,英国罗斯林研究所首次利用羊体细胞获得克隆羊多莉,表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖[1]。同年,乳腺中表达人凝血因子IX的转基因克隆羊Polly培育成功[2]。2005年抗乳房炎转基因牛的诞生[3],2006年多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功[4],标志着转基因动物育种进入了新的发展历程。2009年生产高比例的抗原特异性人源抗体的转染色体牛的出生[5],是转基因动物生产药用蛋白的又一个里程碑。

随着基因工程技术的不断发展,从显微操作技术、体细胞核移植技术、精子介导载体法和胚胎干细胞介导法等传统转基因动物生产方法,到结合基因打靶技术、生殖干细胞介导法和锌指核酸酶介导的敲除或转基因技术等现代生产方法的不断出现,转基因技术将会不断得到完善,这项技术必将在未来的动物育种中将发挥巨大的作用。

1 传统的转基因技术

1.1 显微操作技术

显微操作技术(micromanipulation technique):是用精细的显微注射针将外源基因直接注入牛受精卵的雄原核,使外源基因整合到基因组,从而获得转基因动物。

1982年,Palmiter等首次将大鼠生长激素基因与金属硫蛋白基因启动子拼接成融合基因,导入小鼠受精卵后,获得了转基因级鼠。现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上改进进行的,显微注射技术是一种应用比较广泛、效果比较稳定的转基因动物制作方法,在转基因牛的研究中,Brandl等[6]利用该方法成功制作成了转基因兔、转基因猪和转基因绵羊。目前通过显微注射法已经获得的转基因动物有小鼠、兔、猪、羊、牛和鱼等。

1.2 体细胞核移植技术

体细胞核移植技术(nuclear transplantation of animal somatic cells):是先把外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞,组成重构胚胎,再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩后便可得到转基因动物。

1997年,首例体细胞核移植绵羊在世界上诞生,之后不久出现了体细胞核移植小鼠及牛,并通过体细胞核移植技术制作了转基因动物。体细胞克隆不同于其它供体细胞,它为转基因技术开辟了新的纪元,事实证明了选择体细胞作供体细胞能生产高比例的转基因后代。在体细胞核移植生产转基因动物过程中,人们将绿色荧光蛋白导入供体细胞,使重构建的转基因胚胎便于鉴定,通过转绿色荧光蛋白体细胞核移植已生产出了转基因后代小鼠、猪和牛。

1.3 胚胎干细胞介导法

胚胎干细胞介导法(embryonic stem cell-mediated):首先将基因导入胚胎于细胞;然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成,形成嵌合体,再将这种嵌合体动物与正常动物连续交配,则可生产出转基因动物。

1.4 精子介导载体法

精子介导载体法(sperm-mediated gene transfer):使具有受精能力的精子与外源 DNA一起孵育,然后将该精子用于人工授精或体外受精,以期获得转基因动物。

1989年,科学家首次利用小鼠精子与DNA温育产生转基因小鼠。由于结果不稳定,目前,该方法体系还未完全建立成熟,但是它是非常有发展前途的一种方法。它可以与体外受精、早期胚胎阳性选择和胚胎超低温保存技术相结合,使转基因技术更加实用化、简单化。

1.5 逆转录病毒载体法

逆转录病毒载体法(retrovirus-mediated gene transfer):主要是利用其DNA的LTR区域的活性特点,将外源基因连接到LTR下部进行重组后,包装成高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵,或微注入囊胚腔中。病毒载体进行转基因是一种温和的转基因方法,同时也是对细胞损伤较小的一种转染方式,并且可以得到较高的转染效率。

1985年,Jaenisch等人成功地用逆转录病毒法获得了转基因小鼠。2007年,Ryu等[7]利用病毒载体感染精原干细胞,再将其注射到大鼠睾丸中,得到的转基因大鼠表达的外源基因可以稳定遗传。

2 现代的转基因技术

2.1 基因打靶技术(提高转基因精确性)

基因打靶技术(gene targeting protocols):是指通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。该技术可细分为:胚胎干细胞基因打靶;体细胞基因打靶和条件性基因打靶。该技术克服了随机整合的盲目性和危险性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

2000年,McCreath等[12]首次利用基因打靶技术生产了转基因克隆羊,证实了基因打靶技术可用于生产转基因大家畜。2003年,Yutaka等[13]利用基因敲除的方法获得了1,3半乳糖苷转移酶基因灭活的转基因牛,首次在牛中实现了基因打靶技术。

2.2 RNA干扰介导的基因沉默技术(提高转基因精确性)

RNA干扰(RNA interference,RNAi):是双链RNA介导的特异性基因表达沉默现象。利用该方法,可以部分地抑制特定内源基因的表达,或通过mRNA的降解使目的基因表达下调沉默,从而实现基因表达调控的时空性和可逆性。

2005年,Acosta等[14]设计了斑马鱼Myostatin基因的干扰片段并注入其受精卵,这段干扰片段解除该基因对肌肉组织生长和发育的抑制作用,产生肌肉发达的斑马鱼。2007年,Dickins等[15]将启动子四环素反应元件(T RE)与RNA干扰基因结合后转入小鼠中,成功转入的小鼠再与转有转录因子(tTA)的小鼠杂交,制备出同时含有 TRE、RNA干扰基因以及tTA的转基因小鼠。

2.3 诱导多能干细胞转基因技术(提高转基因精确性)

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells):是将几种转录因子转入已经分化的体细胞中,使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。在转基因动物研究中,将iPS细胞诱导技术同动物转基因技术相结合是一种创新,应用该方法不仅可以避免种间繁殖障碍,克服亲缘关系的制约,而且可获得用传统的交配方法无法得到的动物新性状。

2006年,日本京都大学Takahashi等[16]将携带有Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc四种限定因子基因的逆转录病毒载体导入小鼠成纤维细胞,结果显示转入限定因子的成纤维细胞被诱导重编程为胚胎干细胞样的多能性细胞,该细胞被称为“诱导多功能干细胞”。

2.4 慢病毒载体技术(提高转基因效率)

慢病毒载体技术(lentiviral vector-mediated gene transfer):慢病毒隶属于逆转录病毒,由于具有较长的致病潜伏期因此被称为慢病毒,它包括爱滋病病毒,猫科免疫缺陷病毒以及其他相关病毒。基于对爱滋病病毒HIV-1的研究,科学家已研发出极具吸引力的慢病毒载体技术系统,该系统可将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的基因,或抑制靶基因的表达。

目前,转基因研究中,使用最多的病毒载体是慢病毒。慢病毒载体技术是一种高效的转基因动物制备技术,转基因效率可达60%以上。2003年,Clark等利用慢病毒载体制备转基因动物的效率高达80%～100%。

2.5 生殖干细胞法(提高转基因效率)

1) 精原干细胞法(spermatogonial stem cells),即将外源基因整合入精原或卵原干细胞中,就有可能连续不断地获得成熟的结合有外源基因的精子或卵子,经过体外受精过程,获得整合有外源基因的转基因动物。一般采用的技术方法为将DNA直接注射入睾丸、卵巢或者曲细精管中。

1994年,Brinster等[8]首先建立了该技术,并实现了供体小鼠的精原干细胞在受体中进行精子发生和单倍体的生殖遗传。2008年,Honaramooz等[9]通过腺病毒携带GFP报告基因转染体外培养的山羊精原干细胞,采精后进行体外受精,转基因胚胎阳性率可达10%。这是第一个成功通过精原干细胞移植的方法进行大家畜转基因研究的报道,为建立转基因大动物模型带来了希望。

2) 原始生殖细胞法(primordial germ cells),是指能够发育成为精子或卵子的祖先细胞,来源于胚胎生殖嵴,与来源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞同属全胚层多能干细胞。

2002年,Natio等[10]从早期鸡胚血液分离得到了原始生殖细胞法,利用脂质体法导入LacZ基因,然后注入受体胚,在鸡胚的生殖嵴表达了LacZ基因。2006年,Van de Lavoir等[11]将携带有绿色荧光蛋白基因的原始生殖细胞法注入孵化鸡胚内,将孵化出的公鸡与未转入基因的母鸡交配,成功获得生殖腺转入外源基因并带有绿色荧光的雏鸡。

2.6 转座子介导的转基因(提高外源基因的整合效率)

转座子又称跳跃基因,它是基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段。它能够在基因组内自我复制,并随机插入基因内其它位点。

2005年,复旦大学发育生物研究所的科研人员改造了一种源于飞蛾的PB(Piggy Bac)转座子可在小鼠等哺乳动物细胞中高效导入外源基因,并稳定表达[17],从而创立了一个高效实用的哺乳动物转座因子系统。这种技术可以将外源基因高效地整合到基因组中转座酶目标序列上,很大程度上提高了外源基因的整合效率。

2.7 人工染色体介导转基因(提高外源基因的表达量)

人工染色体介导转基因(artificial chromosome gene transfer):是体外重组的含有类似天然染色体组件的具有特定结构的DNA分子。常见的有酵母人工染色体(YAC),细菌人工染色体(BAC),哺乳动物人工染色体(MACs)等。传统转基因研究中,由于外源基因不能携带足够的调控元件以及受到染色体位置效应的影响,往往表达量很低,甚至不表达或者异位表达,这些都不利于转基因动物的研究。由于人工染色体含有较多的调控元件以及侧翼序列,受染色体位置效应的影响较小,人工染色体的出现可以弥补上述不足,实现外源基因较高水平的表达。

2008年,杨鹏华[18]等将含有人乳铁蛋白的BAC和GFP质粒共注射,得到了乳腺特异性高表达乳铁蛋白的转基因克隆牛。近两年出现的RED/ET重组系统(Red/ET recombination)可以对BAC在细菌中进行精确修饰,比如对BAC修饰后加入药物筛选基因,然后通过电转染的方法将含有筛选标记基因的BAC导入体细胞并进行药物筛选,将筛选得到转基因阳性细胞进行核移植。这样克服了显微注射方法效率低的缺点,提高了使用BAC进行转基因的效率和实用性。

2.8 锌指核酸酶介导的敲除或转基因技术(提高外源基因的高效定点整合)

锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs):由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列锌指蛋白串联组成,每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指核酸酶能识别特异的DNA序列,并在此特异位点产生一个DNA双链切口,而后细胞固有的DNA修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复,从而达到DNA靶向修饰的目的。锌指核酸酶技术不仅将基因组靶向修饰的效率提高了3～5个数量级,而且具有极高的特异性。锌指核酸酶激活了体内的DNA损伤修复机制,可以大大提高基因打靶的效率。

2009年,Hockemeyer等[19]利用ZFN对人的ES细胞和iPS细胞设计4对锌指酶对OCT 4基因位点进行打靶时发现,有2对锌指酶诱导的同源重组效率达到36%～94%。2009年,Geurts等[20]直接将ZFNs质粒或者编码ZFNs的mRNA直接注射到大鼠原核或者胚胎胞质中,得到的子代大鼠检测发现IgM基因和Rab38基因敲除的效率高达25%～100%,并且子代老鼠中发现一只实现了一次对两个等位基因的敲除,而这在传统的基因打靶中几乎是不可能的。这种高效率的基因打靶使得基因敲除变得简便易行,极大地方便了基因功能的研究和疾病模型的建立。同时,ZFN的应用提高了同源重组的效率,在供体基因存在的情况下,实现了外源基因的高效定点整合。但是ZFN进行基因打靶也存在脱靶的问题,有可能造成不可预知的后果,这需要在以后的研究中进一步提高ZFN的特异性。

3 转基因牛的研究进展

3.1 国外研究进展

1990年,荷兰Pharming公司通过显微注射法获得世界上第一头转入有人乳铁蛋白基因的公牛。该公牛与非转基因母牛生产的转基因后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白。

1998年,日本的科学家Cibelli等采用母牛输卵管和子宫内膜细胞为核供体获得了世界首例体细胞克隆牛。同年,他们以胎儿成纤维细胞为核供体,用同样的方法获得了携带半乳糖苷酶外源基因转基因牛。

2001年,Krimpenfort等利用显微注射技术向牛体外受精早期胚胎注射外源基因,通过非外科手术法进行胚胎移植,在所生的19头牛中,经检测有2头为转基因牛。

2002年,Berkel等利用牛的酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2 kb片段构建转基因载体,通过显微注射获得转基因牛。

2002年,新西兰与澳大利亚科学家合作也获得了转基因体细胞克隆牛。

2002年,Donovan等将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛,证明在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎[21]。

2003年,日本的科学家Yutaka等利用基因敲除的方法获得了α-1,3半乳糖苷转移酶基因单等位基因灭活的转基因牛,首次在牛中实现了基因打靶[13]。

3.2 国内研究进展

1999年,上海医学遗传研究所黄淑帧等,利用向体外受精的早期胚胎中注射外源基因的方法成功培育出了我国第1头转入有人血清白蛋白基因的转基因牛。

2002至2006年,中国农业大学李宁教授及其科研团队利用转基因体细胞克隆技术,获得了转基因克隆奶牛49头,存活29头。人乳铁蛋白、人α乳清白蛋白和人溶菌酶在转基因牛乳中平均表达量达到了国际上最好水平。

2003年,中国农业大学李宁课题组培育了10头体细胞克隆牛。其中包括两头转基因体细胞克隆牛:“乐娃”和“岩娃”。“乐娃”转入了绿色荧光蛋白基因,“岩娃”创造了两个世界首次:首次转有人岩藻糖转移酶基因;首次在同一头牛中转有3种外源基因(绿色荧光蛋白基因、人岩藻糖转移酶基因和新霉素抗性基因)。标志着我国转基因体细胞克隆牛的生产技术体系已经渐趋成熟。

2006年4月,中国工程院院士旭日干指导完成的体细胞克隆牛和转基因克隆牛技术研究通过专家鉴定,该项目获得内蒙古首批3头体细胞克隆牛、首例胚胎冷冻保存的体细胞克隆牛和首例携带有人胰岛素基因的转基因克隆牛。

2006年世界首例抗疯牛病转基因克隆牛在中国山东淄博诞生。

2010年5月,国家转基因肉牛育种课题组主要成员在国家肉牛改良中心良种牛繁育场,实施了首批转ω-6脂肪酸脱氢酶基因(FAT 1)的肉牛胚胎移植工作。

2010年7月,内蒙古大学大动物研究中心与内蒙古科维尔有限公司联手育出转基因克隆肉牛。这种转基因克隆肉牛是在动物耳朵上提取细胞,再通过无性繁殖人工培育而成。这种牛因剔除了肌肉生长抑制素基因(Myostatin),从而与其他牛相比产肉量更多,肉质优良。

4 转基因牛的应用

4.1 研究基因功能和治疗人类疾病

通过转基因技术,可以精确地失活或增强某些基因的表达,研究基因功能,制作各种研究人类疾病的动物模型。利用转基因技术建立人类疾病动物模型比其他方法有优势,它可以在动物原来遗传背景的基础上,通过改变某种基因的表达水平而实现,用以研究外源基因在整体动物中的表达调控规律,从而对人类疾病的病因、发病机理和治疗学产生极大的促进作用。

日本科学家Kuroiw a等[22]将微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)与体细胞克隆技术相结合,把含有整个人类免疫球蛋白重链基因Ig H和轻链基因Igλ的染色体片段转入牛的原代胎儿成纤维细胞,获得了4只健康存活的转基因克隆牛,它们的血液中能不同程度表达人类多克隆抗体,这些转染色体牛无疑会极大地促进利用动物生物反应器大量生产人源化的抗体、酶、牛奶和其他药用蛋白的研究工作。

李宁院士与合作者用转基因克隆技术将人的岩藻糖转移酶基因植入牛的基因组内,使其在牛奶中含有岩藻糖抗原,这种转基因牛奶可作为口服药,用来防治各种胃病,具有重要的医学价值和经济社会价值。

4.2 应用于生物反应器,生产药用蛋白

通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白,一直是转基因动物研究的热点。从1987年Gordon等人在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子,到现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达,这些蛋白可以用于治疗人类相关疾病。

1990年12月,荷兰Pharming公司用酪蛋白启动子与人乳铁蛋白(h LF)的cDNA构建了转基因载体,通过显微注射法获得世界上第一头名为 Herman的转基因公牛。该公牛与非转基因母牛生产的转基因后代中1/4后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白。2002至2006年,中国农业大学李宁教授及其科研团队利用转基因体细胞克隆技术,获得了转基因克隆奶牛49头,存活29头。人乳铁蛋白在转基因牛乳中平均表达量达到3.43 g/L,人α乳清白蛋白表达量也达到1.55g/L,人溶菌酶在转基因牛乳中含量达1.50 g/L以上,这些重组蛋白表达量达到了国际上最好水平。

近十几年来,在利用转基因技术制取新药方而取得了惊人的成就,目前已在牛的乳汁中生产出一些人类蛋白质药物:抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋白、乳铁蛋白、糖基转移酶、蛋白C等。

4.3 提高抗病能力

2004年,日美联手利用基因工程手段培育出对疯牛病具有免疫力的牛,这种转基因牛不携带普里昂蛋白或其他传染性蛋白。

2005年,Donovan等将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛,证明在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎,转基因牛葡萄球菌感染率仅为14%,而非转基因牛感染率达71%。

2006年,莱阳农学院董雅娟等与日木山口大学合作,成功地培育出2头转有抗疯牛病基因的转基因奶牛。2007年,该研究组的Richt等通过基因打靶技术将牛的PRNP基因双位点灭活,获得了存活两年以上的转基因牛[23]。这些牛在临床解剖、生理发育、组织病理以及免疫和生殖发育方而都很正常,而且在体外试验中能够很好的抵抗疯牛病的传染,这为生产不含肮蛋白的肉、奶制品提供了一种很好的方法。

4.4 改良品种

转基因技术可用于改造动物的基因组,提高家畜的经济性状,如加快生长速度、提高瘦肉率,改善肉质,提高饲料利用率和抗病力等。转基因技术用于育种,不仅可以加快改良进程,提高选择效率,而且不会受到有性繁殖的局限。

2003年,Brophy等研究人员在奶牛的胚胎细胞中加入了两种额外的基因:β-酪蛋白和κ-酪蛋白,由此培育的转基因奶牛所产的奶中β-酪蛋白含量提高了20%,κ-酪蛋白的含量也增加了一倍。

人们利用转基因技术把有利基因转移到肉牛中,使肉牛带有外源基因,且能够在后代中表达出来,对肉牛业的发展和人们生活水平的提高有重要作用。

5 问题与展望

现在转基因动物的应用主要集中在医药方面,在食品工业上的应用很有限,主要原因是转基因的效率太低,建立优质转基因动物品系的时间太长。今后的工作还应集中在现有的技术水平上建立更加简便、经济、有效的转基因技术,制备出外源基因稳定遗传的有生产应用价值的健康动物。随着家畜基因组计划的完成,人类将更有针对性地改良家畜基因,把外源基因插入到对动物生长影响较小的DNA片段中,从而克服随机整合和异常表达给家畜健康带来的问题,而基因打靶等新的转基因技术创造了这种可能。

2008年7月,国务院常务会议审议并原则通过了转基因生物新品种培育科技重大专项,投入资金约200亿元,转基因动物新品种培育已经得到了我国政府的高度重视。转基因动物的研究和应用将是21世纪生物工程技术领域最活跃、最具有应用价值的项目之一。它将给人类的医药卫生、生物材料、家畜改良等领域带来革命性的变化,它所带来的经济效益和社会效益将是难以估量的。

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Current Status of Transgenic animals and Application in Transgenic Cattle Breeding

HUANG Yong-zhen,HE Hua,CHEN Hong＊

(Co llege of Animal S cience and Technolo gy,North west A&F University,Yang ling,S haan xi 712100,China)

Transgenic animals have been applied to all areas of life sciences.It has comprehensive application especially in the bioreactor,drug screening,xenotransplantation,improved varieties and improved production performance of animals and other aspects.In this paper,w e described the history of the transgenic technology and the state of the development,severaltraditionalm ethods of transgenic technology was introduced,some new transgenic technologies of focus on improve transgenic efficiency and precise control in recent years.In addition,research status of transgenic technology in cattle breeding and the application and development prospect of cultivate new varieties by transgenic technology in cattle breeding and biopharmaceuticalapplication and prospect and other fields of research in the future.

Transgenic Animals;Transgenic Efficiency;Precise Controlof Transgenic

S823.2

A

1001-9111(2011)04-0035-06

2011-03-15

2011-04-09

本研究由国家自然科学基金(编号:30972080);国家科技支撑计划(编号:2008BADB2B03-19);农业部肉牛产业体系项目(编号:CARS-38);国家转基因专项子课题(编号:2009ZX08009-157B,2008ZX08007-002,2009ZX08007-005B-07)项目资助。

黄永震(1983-),男,河南南阳人,博士研究生,主要从事动物遗传育种与繁殖研究。

＊通讯作者:陈 宏(1955-),男,陕西西安人,教授,博士生导师,主要从事分子遗传与家畜育种。