术后鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞阳离子蛋白及趋化因子的变化

施祝良，张学渊，黄 洁

(本文编辑:潘雪飞; 英文编辑:王建东)

嗜酸性粒细胞的聚集、活化被认为与鼻腔内黏膜水肿、息肉形成密切相关。我们选择慢性鼻-鼻窦炎不伴息肉(chronic sinusitis without nasal polyps，CRSsNP)患者术后黏膜转归过程为研究对象［1］。通过对手术患者鼻腔黏膜组织中嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)及嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)动态变化的研究，探讨嗜酸性粒细胞聚集、活化与鼻内镜术前、术后鼻腔黏膜转归的关系，为鼻内镜术后的治疗提供依据，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例分组及取材 选取2005年3月至6月我科收治的CRSsNP患者10例为研究对象，所有病例均于术前(术前组)、术后1～2周(术后A组)、术后4～6周(术后B组)及术后10～12周(术后C组)取上颌窦口周边水肿的鼻黏膜组织进行检测。对照组为10例同期鼻中隔偏曲或单纯上颌窦囊肿患者的中鼻甲黏膜(含有少量嗜酸性粒细胞的鼻腔黏膜)。上述标本离体后迅速于液氮中保存备用。鼻内镜术前停用鼻喷激素1周，术中处理泡状中鼻甲、严重鼻中隔偏曲等明显的局部病变，通畅鼻窦引流，手术前后合理使用抗生素，不使用鼻喷激素。

1.2 实验试剂 Immulite化学发光分析仪及配套试剂购自美国DPC公司；大鼠抗人eotaxin多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠的二抗为北京中山生物技术有限公司产品；RIPA蛋白提取试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品。

1.3 检测方法

1.3.1 鼻黏膜组织的裂解及组织总蛋白的测定采用文献［2］方法测定。

1.3.2 鼻黏膜组织中ECP的表达 采用文献［2］方法测定。

1.3.3 鼻黏膜eotaxin的表达 用Western-blot检测。取上述方法提取的组织上清液用N-3(羟甲基)甲基甘氨酸-甘氨酸系统电泳，电转移至0.22 μm硝酸纤维素膜，该膜经含1%牛血清的三羟甲基氨基甲烷生理盐水缓冲液(50 mmol pH 7.5)振摇2 h，于4℃封闭过夜后，与大鼠抗人eotaxin多克隆抗体(稀释度1∶500)在4℃下孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠的二抗(稀释度1∶500)室温下孵育90 min，最后经ECL发光试剂盒显影，X线胶片记录结果，用quantity one Version 4.4软件测定蛋白条带的积分密度(IOD)。

1.4 统计学处理 应用统计软件SPSS 11.0对计量数据行单因素方差分析，SNK法两两比较，两组数据分别进行正态性检验；并行直线相关性分析；以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

ECP及eotaxin鼻内镜术后随时间呈现如下变化规律：①术后1～2周较术前病变黏膜组明显降低；②术后4～6周达高峰，基本恢复至术前水平；③术后10～12周回落，接近于术后1～2周水平。④手术前后鼻腔黏膜ECP及eotaxin的表达呈正相关，相关系数γ=0.719，P=0.004。见表1。

3 讨论

鼻内镜术后黏膜上皮化是一个动态而较长之过程，约需3～6个月时间，期间会出现鼻腔黏膜水肿、囊泡、小息肉，有部分患者不能完成黏膜上皮化，鼻窦炎再次发作；其机制不太明晰，与此相关的细胞因子研究文献不多［3］。本研究通过对鼻内镜手术前后不同时期鼻黏膜组织中和ECP和eotaxin表达的测定，试图从分子水平探讨嗜酸性粒细胞聚集活化对鼻内镜术后鼻腔黏膜上皮化的影响，为鼻内镜术后的治疗提供一定的理论依据。

表1 手术前后鼻黏膜组织中ECP及eotaxin含量的变化()

表1 手术前后鼻黏膜组织中ECP及eotaxin含量的变化()

注：*为ECP含量与组织总蛋白的含量之比/10-6。与术前组比较，#P＜0.05；与术后C组比较，▲P＞0.05

ECP含量代表嗜酸性粒细胞的活性［2，4］。其生物活性主要表现在细胞毒性和非细胞活性两方面。细胞毒性表现为ECP对细胞膜具有破坏作用，在被攻击的细胞膜上形成小孔，使水分子等小分子物质可自由通过，细胞因渗透压下降肿胀坏死；非细胞活性在呼吸道炎症中主要表现为刺激嗜碱性粒细胞释放组胺、呼吸道黏液分泌增加。eotaxin被认为是目前为止发现的唯一能有效选择性激活嗜酸性粒细胞的细胞因子，也被认为对嗜酸性粒细胞趋化作用最强的细胞因子之一［5］。eotaxin在鼻腔黏膜中增多时，表明局部嗜酸性粒细胞增多，并被激活，活化的嗜酸性粒细胞脱颗粒，ECP分泌也随之增加；ECP的攻膜作用使更多的嗜酸性粒细胞溶解，嗜酸性粒细胞内的eotaxin释放，因而ECP及eotaxin在鼻黏膜病变中具有相互促进作用［6-7］。

本实验提示，术后初期鼻腔黏膜ECP及eotaxin的表达较术前明显降低，可能是因为刚手术后鼻腔内病变黏膜及其所包含的炎症细胞、细胞因子明显减少；另外，鼻内镜手术是一个创伤，术后患者应激性肾上腺皮质激素升高，抑制鼻腔嗜酸性粒细胞炎症的发展和细胞因子的表达。术后4～6周ECP及eotaxin的表达明显高于术后10～12周组。表明此期鼻腔黏膜中有较多的嗜酸性粒细胞浸润，且其活性较高。嗜酸性粒细胞被激活后分泌细胞因子增加，由于当时鼻腔黏膜尚未完成上皮化，纤毛功能恢复不全，不能形成“黏液毯”［8］，包括 eotaxin在内的细胞因子不能及时带走，进而募集并激活以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞，这些炎性细胞又分泌各类细胞因子，形成“自我放大”，所以eotaxin表达较多，手术区黏膜水肿明显，部分呈息肉样变［9］。术后2～3个月，鼻腔局部炎症消退，大部分患者鼻腔黏膜逐步完成上皮化。

本实验提示，鼻内镜术后鼻腔黏膜中 ECP、eotaxin的表达呈现动态变化，与鼻腔黏膜的修复转归过程相对应；在临床上，应该加强这段时期的治疗(换药、冲洗、局部用药)，以利尽早完成术后鼻腔黏膜组织的修复［10］。

［1］中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南［J］.中国临床医生，2010，38(4)：73-74.

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［9］夏忠芳，孔维佳，乐建新，等.鼻息肉组织及上皮细胞的形态学特征与嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的表达［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，22(17)：787-789.

［10］关志华，陈立萍，黄超洋，等.鼻后滴漏综合征治疗的临床研究［J］. 东南国防医药，2011，13(3)：234-235.