福建地区汉族人群骨保护素基因rs2073617T/C多态性与急性冠脉综合征病变程度的关系

罗助荣，林 毅，张克己，郑磊磊，徐高阳

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

自发现骨保护素(osteoprotegerin，OPG)在骨代谢调节中的重要功能以来，因其在血管性疾病和动脉粥样硬化中发挥的重要作用引起了人们的广泛关注［1］。但有关OPG基因多态性与急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)的关系，国内鲜见文献报道。本研究旨在分析OPG基因启动子rs2073617T/C位点基因在福建汉族人群中的分布情况，以初步了解其多态性与ACS的发病及病变程度是否存在相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 ACS组360例均符合ACS诊断标准［2-3］，其中男 216例，女144 例；对照组 120 例，男62例，女58例，均为福建地区无血缘关系汉族人。排除标准：合并有急慢性感染、恶性肿瘤、风湿性心脏病、瓣膜钙化、严重肝肾功能异常、重度心功能衰竭、甲状腺或肾上腺功能紊乱、钙代谢异常及免疫系统疾病等均予排除。

1.2 方法

1.2.1 冠状动脉造影 采用Judkins法按常规操作。根据1984年美国心脏协会规定的冠脉血管图像分段评价标准：冠脉造影显示任何1、2、3枝主要冠状动脉一段狭窄＞50%为单枝、双枝、三枝病变，左主干病变计为2枝病变。根据Gensini积分系统对各枝血管狭窄程度进行定量分析：无异常发现为0分、狭窄＜25%为1分、26% ～50%为2分、51%～75%为4分、76% ～90%为8分、91% ～99%为16分、100%为32分，患者冠状动脉病变程度的最终积分为各分枝积分之和。

1.2.2 生化指标测定 清晨空腹采肘静脉血5 ml，3000 r/min(离心半径8 cm)，离心10 min取血清，采用Olympus Au2700全自动生化分析仪检测。

1.2.3 静脉血基因组DNA提取 所有受试者禁食12 h后清晨空腹采血，EDTA抗凝，采用美国OMEGA公司全血DNA分离提纯试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存。

1.2.4 PCR扩增 应用多聚合酶链式反应(PCR)扩增OPG基因启动子rs2073617T/C多态性片段。PCR引物采用Primer Premier 5.0软件设计，由上海生工公司合成。OPG rs2073617T/C上游引物序列：5’-GAAGTGAAGGGGTCAGGCAGC-3，下游引物序列：5’-GTCTGTCTCTCTCTTGCTGTCTTCC-3，扩增反应体系 20μl，其中含灭菌双氧水 12.8μl，10 × PCR反应缓冲液 2μl，dNTPs 0.4μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10 μM)0.4μl，DNA 模板 2μl，Taq酶2 U，覆盖石蜡油。反应条件为：95℃预变性3 min；95℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循环 35 次；72℃ 5 min；2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。

1.2.5 扩增产物的限制性酶切和DNA测序检测 OPG rs2073617T/C PCR产物分别用HincII限制性酶(TaKaRa公司)于37℃水浴消化16 h，并经电泳证实。同时PCR产物利用ABI370型DNA测序仪(ABI公司，USA)进行测序鉴定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件。计算各基因型及等位基因频率，两组间基因型分布做Hardy-Wrinberg平衡分析，以确定研究样本的群体代表性。计量资料以表示。组间计量资料比较采用方差分析或t检验，各组之间基因型和等位基因频率分布采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组年龄、性别、体重指数、高血压、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)的差异均无统计学意义(P＞0.05)，ACS组吸烟、糖尿病、HDL-C显著高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 研究对象的Hardy-Weinberg平衡检验 OPG基因rs2073617T/C多态性基因型分布在两组中的观察值与理论值相吻合，表明研究对象符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。

2.3 OPG rs2073617T/C基因多态性 经HincII限制性酶酶切后可见三种基因型：855 bp处出现单个条带为TT纯合子，杂合子TC产生855 bp、460 bp和395 bp三条带；纯合子CC产生395 bp，460 bp二条带。DNA测序鉴定的结果亦证实上述rs2073617T/C位点3种基因型的存在。电泳图和测序图见图1、图2。

图1 OPG基因rs2073617T/C酶切电泳及测序结果

图2 OPG基因rs2073617T/C测序结果

2.4 OPG基因rs2073617T/C多态性分布与比较与对照组比较，ACS组OPG基因rs2073617T/C多态位点的基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P均＞0.05)，见表2。

表2 基因型及等位基因频率在两组间的分布［例(%)］

2.5 OPG rs2073617T/C位点多态性与ACS病变程度的关系 ACS患者根据冠脉造影结果分为单枝、双枝、三枝病变组。其中单枝病变组166例、双枝病变组100例和三枝病变组94例，对照组120例。OPG rs2073617T/C各基因型在四组之间比较的差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。ACS患者三种基因型与冠状动脉Gensini评分间的差异亦无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表3 OPG rs2073617T/C位点多态性与ACS病变枝数的关系［例(%)］

表4 OPG rs2073617T/C基因多态性与冠脉病变枝数Gensini评分的关系

3 讨论

OPG于1997年在美国和日本两家实验室同时被发现［4-5］，它是一种分泌型糖蛋白，其前体含有401个氨基酸的残基，N-末端的21个氨基酸为信号肽序列，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，其mRNA在多种组织广泛表达，如心脏、肺、甲状腺、肾脏和骨等。它与细胞核因子kB受体活化因子配体(RANKL)，核因子kB受体活化因子(RANK)组成OPG/RANKI/RANK系统。OPG系统与骨代谢，心血管系统及免疫系统疾病等都有着密切的关联。

Palazzuoli等［6］发现OPG水平在稳定性冠心病中明显增高，但低于ST段抬高的心肌梗死患者。不稳定心绞痛和非ST段抬高的心肌梗死OPG水平升高但无显著差异。Omland等［7］研究发现，与传统的危险因素相比，OPG可以更好的预测急性冠脉综合征患者远期死亡率和心力衰竭的发生。以上研究表明，OPG不仅能够参与骨代谢，而且参与动脉粥样硬化的进展，并与ACS的发病及预后密切相关。因此，探讨OPG基因多态性与ACS间的相关性具有重要意义。

人类OPG基因是单拷贝基因序列，全长29 kb，位于染色体8q23-24上具有5个外显子。国外一些学者［8］初步发现 OPG 950以及1181位点，其多态性与血管中层钙化密切相关。我们研究发现在福建地区汉族人群中，OPG基因rs2073617T/C多态性存在TC、TT、CC三种基因型，其在ACS组和对照组中的频率分别为 43.3%、33.3%和 23.3%，以及47.7%、26.7%和25.6%，两组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)；Ohmori等［9］对日本男性冠心病患者血清OPG进行研究，结果显示OPG基因型950C/C与ACS显著相关，并且与血清OPG水平的升高有关。本研究根据造影结果将ACS患者分为单枝、双枝、多枝病变组，并分析其与OPG基因多态性的关系，结果发现OPG基因rs2073617T/C基因型及等位基因频率与冠状动脉病变枝数间差异无统计学意义(P均＞0.05)；对ACS患者病变程度Gensini评分，分析其与三种基因型间的关系显示差异亦无统计学意义(P＞0.05)。Soufi等［10］研究发现 OPG不同位点的基因型与冠心病相关性差异较大，应用多聚合酶链式反应-梯度凝胶电泳判别OPG基因发现存在多个突变位点：149 T/C、163 A/G、209 G/A、245 T/G、950 T/C(以上位点都在启动子区域)、1181 G/C(位于第l外显子)6890 A/C(位于第4内含子)。单个位点基因多态性与冠心病发生虽无独立相关性，但950 T/C和1181 G/C位点的联合多态性分析显示携带950 TC/1181 GC或950 CC/1181 CC基因型的患者具有冠心病发病的高危因素。

本研究发现OPG基因rs2073617T/C多态性与福建地区汉族人群中ACS的发生及冠状动脉病变程度无相关性。但并不能说明OPG基因多态性与ACS没有关系，因为本研究仅选取了OPG基因的一个多态性位点，即OPG 950位点，很明显探讨OPG基因多个位点及连锁多态性与ACS的相关性将更具有意义。

［1］罗助荣.骨保护素系统与动脉粥样硬化的研究进展［J］.东南国防医药，2010，12(6)：523-525.

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［6］Palazzuoli A，Ascione R，GallottaM，et al.Osteoprotegerin and B-type natriuretic peptide in acute coronary syndromes with preserved systolic function：relationto coronary artery disease extension［J］.Int J Cardiol，2009，137(3)：295-298.

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［8］Hofbauer LC，Schoppet M.Osteoprotegerin gene polymorphism and the risk of osteoporosis and vascular disease［J］.JACC，2002，87(9)：4078-4079.

［9］Ohmori R，Momiyama Y，Taniguehi H，et al.Association between osteoprotegerin gene polymorphism and coronary artery disease in Japanese men［J］.Atherosclerosis，2006，187(1)：215-217.

［10］Soufi M，Schoppet M，Sattler AM，et al.Osteoprotegerin gene polymorphisms in men with coronary artery disease［J］.Clin Endocrinol Metab，2004，89(8)：3764-3768.