生长抑素及其功能性受体表达与胰腺腺泡细胞外分泌的关系

蔡 佳,黄文祥

(重庆医科大学附属第一医院感染科 400016)

生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR)有5种不同的分子亚型SSTR1～5,广泛分布于脑、胰腺、甲状腺及胃肠等组织,各亚型受体在组织中的分布也有差异[1-2]。目前,生长抑素已广泛应用于消化系统疾病(如急性胰腺炎、肝硬化门静脉高压、上消化道出血等)及肿瘤(如神经内分泌肿瘤和胃肠道类癌瘤等)等的治疗[3-4]。胰腺腺泡细胞上的各SSTR类型分布目前还存在争议。有研究证实,生长抑素可与胰腺腺泡细胞上的SSTR结合,直接抑制胰腺分泌和淀粉酶分泌。但是胰腺腺泡细胞上与生长抑素结合发挥抑制胰腺外分泌作用的受体是哪一种受体或亚型还不清楚。本研究初步探讨SD大鼠胰腺腺泡细胞上SSTR各亚型的分布及生长抑素的功能性受体亚型。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂及配制 Trizol(Invitrogen公司)、SSTR1～5引物(Invitrogen公司合成),DNA maker 100 bp ladder(SABC公司),莫落尼鼠类白血病毒(murine moloney leukemia virus,MMLV)逆转录酶、Taq-DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Rnasin(Promega公司),焦磷酸乙二脂(diethy lpyrocar bonate,DEPC,Sigma公司)。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyerhyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid,HEPES)缓冲液的配制(氯化钠135 mmol/L,氯化钾 5.0 mmol/L,氯化钙2.0 mmol/L,氯化镁1.2 mmol/L,葡萄糖10.0 mmol/L和、HEPES 10 mmol/L,用 Tris-HCl调至pH 为 7.4)。Ring′s液的配制由氯化钠3.79 g、磷酸二氢钾27.2 mg、磷酸氢二钾182.4 mg,硫酸镁 123.2 mg、碳酸氢钠1.05 g、醋酸钠 680 mg、D-glucose 495 mg、α酮戊二酸 73.05 mg、甘氨酸75.07 mg、氯化钙72.14 mg加入500 mL三蒸水中,磁力搅拌混匀后,用 Tris-HCl调 pH为7.35,高压灭菌后 4℃保存待用。消化液采用胰蛋白酶抑制剂和Ⅳ型胶原酶配制,加入Ring′s液使其充分溶解,终浓度分别为0.5 mg/mL和0.8 mg/mL。-20℃保存备用。

1.2 胰腺腺泡细胞的分离、制备及分组 首先脱颈处死雄性SD大鼠(体质量250 g左右),立即取出胰腺。在培养皿中用生理盐水清洗数次,洗净血液并除去系膜和脂肪组织。将胰腺用细针固定于蜡板或琼脂板上,使组织充分展开。用眼科剪将胰腺组织剪成大小约1～2 mm3组织块。将组织块移入含有胶原酶和胰蛋白酶抑制剂的Ring′s缓冲液中。含有胰腺组织的缓冲液中充入95%O2,在37℃恒温震荡水浴箱(振荡频率每分钟60次)中孵育7 min。孵育过程中用口径约1～2 mm的已过火的玻璃吸管轻轻抽打混合。沉淀在试管底部的胰腺腺泡细胞用不含消化酶的Ring′s缓冲液离心洗涤(1000 r/min×3 min),吸除含胶原酶和破碎细胞的上清液,重复此步骤,共清洗3次。洗涤后的胰腺腺泡细胞用孔径150 μ m的尼龙网过滤,过滤即得到所需的胰腺腺泡细胞。胰腺腺泡细胞的纯化:(1)用血细胞计数板对沉淀的胰腺腺泡细胞计数,将细胞悬液稀释至1×107个/mL。(2)将等量的细胞悬液分装入5个试管中,分别编号为1、2、3、4、5号管。向1、2号试管中分别加入生长抑素,其终浓度为10-7mol/L。3、4、5号试管中加入等体积的Ring′s液作为对照。(3)将装有细胞悬液的试管放入37℃恒温震荡水浴箱(振荡频率60次/min)中孵育,整个过程向试管中充入 95%O2。1、3号试管孵育时间为 15 min,2、4号试管孵育时间为30 min,5号试管孵育时间为0 min(对照)。(4)孵育完毕后将细胞悬液转入EP管中离心(1000 r/min×3 min),弃去上清液,得到胰腺腺泡细胞沉淀。

表1 RT-PCR法检测胰腺腺泡细胞SSTR1～5表达水平

1.3 RT-PCR法检测胰腺腺泡细胞SST R1～5表达 见表1。(1)94°C、3 min灭活M-M LV逆转录酶;(2)按表2完成PCR扩增;(3)72°C、10 min最终延伸;(4)4°C保存待检;扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳,观察结果使用Labimage图像分析系统对电泳结果进行量化分析。

表2 胰腺腺泡细胞SST R 1～5的RT-PCR检测参数

1.4 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行统计学数据分析,计量资料以表示,采用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SSTR1～5 mRNA的表达水平 结果位于390、390、415、365、250 bp处的条带均有表达,见图 1。5号试管胰腺腺泡细胞 SSTR1～5 mRNA表达的相对量分别为0.980±0.085;0.766±0.064;0.850±0.078;0;2.010±0.225(图 2)。SSTR1、SSTR5 mRNA表达较高。β-actin mRNA的扩增片段为180 bp,2、4与5号试管SSTR1～5 mRNA表达的相对量间差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 对照组SSTR1～5 mRNA表达

2.2 15、30 min后的SSTR1～5 mRNA的表达水平 生长抑素作用15 min后SSTR1～5 mRNA表达相对量分别为0.908±0.059;1.142±0.078;0.798±0.030;0;1.852±0.132(图3)。生长抑素作用30 min后SSTR1～5 mRNA表达相对量分别为0.891±0.049;1.347±0.063;0.764±0.071;0;1.791±0.102(图4)。生长抑素作用后SST R2表达较对照明显增高(P＜0.05,n=5)(图5)。30 min与 15 min相比,SSTR2 mRNA表达量明显增高(P＜0.05,n=5)。

图2 生长抑素作用15 min后SSTR1～5 mRNA表达

图3 生长抑素作用30 min后SSTR1～5 mRNA表达

图4 生长抑素作用后胰腺腺泡细胞上SSTR的表达

图5 生长抑素作用于胰腺腺泡细胞不同时间后SSTR2 mRNA表达

3 讨 论

生长抑素及其类似物可通过与细胞膜上SSTR结合而发挥作用,根据生长抑素的这一特性,可以利用生长抑素靶向结合SSTR来诊断和治疗疾病,靶向治疗高效低毒。因此,近年来SSTR在各种疾病中的表达及生长抑素在该疾病中所起作用的研究日益受到重视。关于大鼠胰腺腺泡细胞上SSTR的具体类型及腺泡细胞上与生长抑素结合的特异性受体亚型,目前文献报道较少,同时也存在一定争议。

生长抑素的生理功能由细胞膜上的SSTR介导,SSTR是一种具有 7个跨膜区段的糖蛋白。自1992年 SSTR1和SSTR2被克隆成功至今,已确认SSTR有5种不同的分子亚型SSTR1～5[5]。有研究显示,在人和啮齿动物中各型SSTR mRNA以不同水平广泛表达,各型受体的表达模式不同但又有交叉,并且存在种属差异。本研究结果表明,在SD大鼠胰腺腺泡细胞上确实有SSTR mRNA表达,5个亚型中SSTR1～3、5均有表达,而 SST R4未见表达。有表达的 4个亚型中SSTR5 mRNA表达量明显高于其他3个亚型。而 Hunyady等[6]认为,大鼠胰腺上的生长抑素受体为SSTR2A,而另研究认为,胰腺腺泡细胞上没有SST R2表达[7]。该研究与本实验研究结果存在一定差异,可能与研究动物的种属及实验对象不同有关。

有文献报道,生长抑素通过SSTR1介导抑制胰腺细胞增生[8]。而Bell和 Reisine[9]从电生理实验中观察到 SST R2通过抑制型G蛋白亚单位α 3(Giα 3)与电压依赖性K+通道耦联,并对K+通道起调控作用:受体兴奋使K+通道开放,膜超极化抑制电压依赖性钙离子通道开放,细胞内的钙离子浓度下降,钙离子作为第2信使进一步调节细胞内蛋白磷酸化过程。有文献报道,SSTR2能介导抑制环化酶(adenylate cyclase,AC)活性效应,认为是通过SSTR2B介导,因为SST R2B能通过与其耦联的Giα 1与AC结合,并认为SSTR2的主要作用是抑制生长激素和胰岛素释放,参与中枢整合作用。Strowski等[10]利用广泛表达SSTR的小鼠和SSTR2基因敲除的小鼠来研究介导生长抑素抑制胰岛素和胰高血糖素分泌的受体亚型,结果进一步证明,生长抑素抑制胰高血糖素分泌主要通过SSTR2介导的,而胰岛素的分泌主要通过SSTR5调节。Tirone等[11]也认为,是通过小鼠胰腺beta细胞上的SSTR5调节胰岛素分泌。其他一些研究也证实,SSTR2在生长抑素抑制胆汁分泌和促进胆汁吸收来调节胆管内胆汁形成[12-13]、抑制胃酸、抑制壁细胞分泌及抑制胰腺癌生长中起重要作用[14-15]。因此,SSTR2被认为是与生长抑素生物学活性密切相关的受体。

本研究利用RT-PCR检测生长抑素作用0、15、30 min后的SSTR mRNA表达量的变化,试图找到生长抑素具体作用的受体亚型。结果表明,SSTR2 mRNA表达量随时间有上升趋势,其差异有统计学意义。而其余的 SSTR1、SSTR3、SSTR5 mRNA表达量的改变差异无统计学意义。生长抑素与胰腺腺泡细胞作用后,SSTR2 mRNA表达随作用时间而逐渐上调,推测生长抑素通过与胰腺腺泡细胞上的SSTR2结合发挥其抑制胰酶合成和分泌作用,SST R2可能是胰腺腺泡细胞上与生长抑素有高度亲和力的功能受体。

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