高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血细胞的动态变化

孙广力,蔡雪辉,郑世民,刘永刚,孙 刚

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.黑龙江省动物卫生监督所,黑龙江 哈尔滨 150069;3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江 哈尔滨 150001)

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(high pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)感染仔猪,可引起与血液循环变化密切相关的病理改变。本试验在以HuN4株PRRSV感染60日龄长白仔猪建立疾病模型基础上,研究了外周血细胞的动态变化,分析了其与PRRSV载量的关系,旨在探讨HP-PRRS的发生、发展及转归机制,为HP-PRRS的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 病毒 PRRSV HuN 4株(Gen Bank序列登录号为EF635006),由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室分离、鉴定[1]。

1.2 实验动物 60日龄长白猪29头,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供,经荧光定量 RT-PCR[2]和ELISA方法检测PRRSV抗原、抗体均为阴性。

1.3 主要仪器设备 ABX-MICROS-60血液分析仪,法国Horiba ABX公司;荧光定量 PCR仪,澳大利亚Corbett Research公司。

1.4 主要试剂 RNeasy Plus Mini RNA试剂盒,Qiagen公司生产;禽源反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂、r Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶,均为TaKaRa公司产品;RT-PCR引物和探针由韦天超设计,上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 试验设计

1.5.1 实验动物分组及其处理 29头仔猪随机分为:病毒感染组(18头,简称Ⅰ组)和对照组(11头,简称C组)。其中,Ⅰ组仔猪,经滴鼻感染HuN 4株PRRSV稀释液,3 mL/头;C组仔猪,经相同途径给予无PRRSV的细胞培养物。两组仔猪严格隔离,相同条件下分别饲养。

1.5.2 被检材料的采集 分别于感染后1、3、5、7、14、21、28 、35、42、49 d 和 63 d,经前腔静脉采血 4 mL。其中,2 m L分离血清,-20℃保存,病毒载量检测用;2 m L以EDTA-K2抗凝,用于血常规检测。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 临床症状和病理变化观察 试验期内每日测量仔猪体温,观察并记录临床症状。分别于病毒感染后1、3、5、7、14、21、28、35、42、49 d 和 63 d,Ⅰ组剖杀 2头仔猪,C组剖杀1头仔猪,检查病理变化。

1.6.2 血细胞数量检测及方法 WBC、RBC、HGB、HCT、PLT 等 18项指标,应用 ABX-MICROS-60血液分析仪进行检测。

1.6.3 病毒载量的检测 参照文献[2],采用荧光定量RT-PCR检测。

引 物 序 列:PNPF:5′-CCCTAGTGAGCGGCAA TTGT-3′;PNPR:5′-TCCAGCGCCCTGATTGAA-3′;探 针 NP-probe:FAM-TCTGTCG TCGA TCCAGA-MGB。

1.7 数据统计分析 数据用Microsoft Office Excel2003电子表格处理,做相关回归分析及F和t检验,分析组间差异。

2 结果

2.1 临床症状和病理变化 PRRS病毒感染仔猪后3 d,体温开始升高,出现精神沉郁,厌食;第 7天体温超过41℃,持续7 d,至30 d恢复正常。病毒感染7d后,I组仔猪出现血性眼屎,全身发绀,不能站立,发病率100%;7～14 d,共计死亡5头,死亡率27.78%;耐过仔猪发育迟缓。对照仔猪未见异常。

死亡和濒死仔猪病理剖检可见,肺脏呈暗红色,表面有不规则出血点或斑;淋巴结体积增大,呈大理石样外观;扁桃体出血;脾脏出血、坏死;肾表面有弥漫性针尖大出血点;脑沟、脑回间静脉显露、出血;其他脏器静脉努张、出血。对照仔猪未见异常。

2.2 血细胞变化 PRRSV感染仔猪外周血WBC于感染后 3～42 d显著下降(P＜0.05);RBC、HGB、HCT在感染后7d显著下降(P＜0.05),14 d升高(P＜0.05),21 d再下降(P＜0.05),35 d再次升高;MCV、MCH、RDW 与对照仔猪无统计学差异;PLT在病毒感染后3～63 d和3～42 d显著下降(P＜0.05)(表1)。

2.3 HP-PRRSV感染仔猪外周血病毒载量变化PRRSV感染仔猪外周血 PRRSV RNA于感染后3～63d病毒载量均超过 103copieso/mL;其中,14 d,病毒载量达到最大值,为 109.86±1.24copieso/m L;至 63 d时,仍可检测到PRRSV RNA(表2)。

2.4 HP-PRRSV感染仔猪外周血血细胞变化与病毒载量的相关性 PRRSV感染仔猪,其病毒载量与WBC、PLT存在中度负相关(0.40＜r＜0.69),与HGB、MCH 存在低度负相关(0.20＜r＜0.39),与 RBC、HCT、MCV、RDW 等相关性可忽略(r＜0.19)(表3)。

3 讨论

本试验结果显示,PRRSV感染仔猪后,其外周血WBC、PLT 显著下降,RBC、HGB、HCT、MCV 、MCH、RDW等呈周期性变化;PRRSV感染仔猪外周血病毒载量与WBC、PLT、HGB、MCH 变化存在相关关系。表明PSS RV感染可导致仔猪外周血白细胞、红细胞和血小板发生病理性改变。

Rossow等[3]报道,SPF猪感染PRRSV后,外周血白细胞减少。罗超[4]研究认为,PRRSV感染初期,仔猪WBC减少主要源于淋巴细胞。WBC减少,特别是淋巴细胞减少,说明PRRS仔猪免疫被抑制。本试验,病猪WBC减少与病猪表现明显临床症状及发生死亡时间吻合,提示其与HP-PRRSV感染所致的临床和病理表现有关,可作为诊断及预后的参考依据。

表1 HP-PRRSV感染仔猪外周血细胞数量动态变化

表2 HP-PRRSV感染仔猪外周血病毒载量

表3 HP-PRRSV感染仔猪外周血细胞与病毒载量相关性

感染性溶血,可表现为RBC、HGB、HCT降低,而MCV、MCH、MCHC不变[6]。急性溶血性贫血时,骨髓造血功能代偿性增强,有时临床上不表现贫血症状。本试验,PRRSV感染仔猪 RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、RDW 变化为典型的急性病毒性溶血,并表现出机体代偿特点。

血小板减少是DIC诊断指标之一[7]。罗超[4]和娄忠子等[8]研究证实,HP-PRRS患猪 PLT下降。张妙红[9]和马国文[10]等研究认为,HP-PRRS仔猪有局部和全身性血液循环障碍所致的多系统器官衰竭(MODS)、弥散性血管内凝血(DIC)和休克等。本试验中,感染HP-PRRSV仔猪PLT显著下降,可能与 HP-PRRS仔猪肺、淋巴结、扁桃体等器官发生水肿、淤血、出血等有关。

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