云南商品牛肝菌中易混淆毒牛肝系统学研究*

李树红 ，赵永昌 ，于富强 ，王向华 ，张小雷 ，刘培贵 **

（1.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650204；2.云南农业生物技术重点实验室，云南 昆明 650223；3.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650223）

商品牛肝菌（Commercial bolete）是泛指一类大型、肉质、孔状贸易菌类的名称，但也包括部分具有褶状、产褐色牛肝菌类孢子的伞状高等菌物，如褶孔牛肝菌属（Phylloporus Quél.）的种类等[1]。商品牛肝菌主要由可食牛肝菌组成，其中美味牛肝菌（Boletus edulis complex）是世界著名的美味野生食用菌之一，其它如双色牛肝菌（B.bicolor Peck）、小美牛肝菌（B.speciosus Frost）、深褐牛肝菌（B.obscureumbrinus Hongo）、华丽牛肝菌（B.magnificus W.F.Chiu）、淡灰褐色网柄牛肝菌（Retiboletus griseus Frost）、美柄牛肝菌 （B.calopus Fr.）、茶褐牛肝菌 （B.brunneissimus W.F.Chiu）、 桃红牛肝菌（B.regius Krombh.）、中华牛肝菌（B.sinicus W.F.Chiu）等是云南野生菌贸易市场上的优势种类[2-8]，在夏秋季是市场上非常普遍，深受当地群众喜爱。

但不幸的是由于牛肝菌物种多样性丰富，种间形态相似性高，形态学鉴定相对较困难，以及民间 “以貌择食”的传统习惯，导致食用牛肝菌中毒的事件频繁发生。因此学术界和消费者一致要求探索新的方法来鉴定商品牛肝菌中的混淆毒菌。随着分子生物学的快速发展，基因序列分析对比成为了现实，DNA序列分析技术在揭示大型真菌系统发育及物种鉴定方面受到重视，本研究也就是基于这样的理论，结合形态学特征，应用ITS序列对云南商品牛肝菌中易混淆毒菌展开分子系统学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

在野生菌出菇期赴野生菌主产区的交易市场采集商品牛肝菌及其易混淆毒菌，作为形态学和分子生物学研究材料。

1.1.2 显微形态特征观察使用的试剂

5%和10%氢氧化钾试剂（KOH），1%刚果红试剂（Congo Red），梅氏试剂（Melzer’s eagent），蒸馏水。

1.1.3 ITS序列扩增引物

本研究应用通用引物ITS4和ITS5，对商品牛肝菌及易混淆毒菌的ITS序列进行扩增。引物碱基组成见表1。

表1 ITS区域PCR扩增采用的引物及碱基组成

1.1.4 GenBank中下载的ITS序列

为了加强对比，充分了解各物种种质资源多样性，构建更加趋于自然的牛肝菌系统树，在研究中从GenBank中下载了5条ITS序列，见表2。

表2 分子系统发育学研究中所用材料的GenBank序列号

1.2 方法

1.2.1 显微形态特征的研究

显微观察是形态分类的关键环节，也是构建系统学及分子检测研究的基础，本研究应用现代真菌分类学方法对收集标本进行研究。

1.2.2 DNA提取

CTAB法[9，10]。选取无虫蛀的大型真菌的干样，取适量菌肉，液氮磨碎；加入700 μL 65℃预热的DNA提取缓冲液，轻轻振荡混匀，65℃水浴30 min，期间混匀2次～3次； 加入 230 μL 5 mmol·L-1KAc，冰浴 20 min； 等体积的氯仿:异戊醇（24:1） 抽提 1 次（10000 r·min-1，4℃离心10 min）取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，-20℃静置约 30 min； 离心（8000 r·min-1，4℃离心 8 min），倒去上清液，用80%乙醇和无水乙醇各漂洗1次，晾干， 加入 500 μL TE buffer溶液；加入 20 μL RNAase（1 mg·mL-1），37℃温浴 1 h； 加等体积酚（pH8.0） ∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1） 和氯仿∶异戊醇 (24∶1) 各抽提1次（10000 r·min-1，4℃离心 10 min）； 取上清液，加入2/3倍体积的异丙醇轻摇，沉淀过夜；离心（10000 r·min-1，4℃离心10 min）；沉淀用80%乙醇漂洗，晾干，溶于30 μL TE buffer溶液中，-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增反应体系

PCR扩增反应体系选用50 μL反应体系，其中包括10×扩增缓冲液（含 MgCl2） 5 μL，200 μmol·L-1dNTP 5 μL，5 μmol·L-1的引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.6 μL（2.5 μ·μL-1），DNA 模板 1 μL（量的多少因 DNA 浓度而异），用 ddH2O 定容至 50 μL。

1.2.4 PCR扩增反应程序

PCR扩增反应程序的热循环参数：94℃变性5 min，然后进入连续35个循环（94℃变性0.5 min，56℃退火0.4 min，72℃延伸 0.4 min）， 循环结束后于 72℃延伸 5 min，最后于4℃保存。

1.2.5 PCR扩增产物检测

分别取2 μL PCR产物和Marker与2 μL溴酚蓝混匀，点样于1%的琼脂凝胶上，于1.0×TAE缓冲液中电泳30 min后，再在紫外线凝胶成像仪上观察、照相并记录结果。

1.2.6 PCR扩增反应产物测序及序列比对

PCR扩增产物送上海生工胶回收后测序，测序引物与PCR扩增引物相同。对所得到的序列对照测序的峰形图，仔细核查每一个碱基以确保其准确性。如果同一序列是用不同引物进行扩增，则用SeqMan软件将这些序列进行拼接后再进行比对。将从GenBank中得到的序列与本研究中所测的序列用ClustalX 2.1进行序列比对，确定序列边界，构造矩阵后再进行手工调整以保证对应碱基的同源性，比对完毕后采用PAUP 4.0进行系统发育分析。

1.2.7 DNA序列分析

最大简约性分析（Most Parsimony，MP）

2 研究结果与分析

2.1 基于ITS序列构建的云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌的最大简约树

ITS具有进化速度快、易扩增、GenBank中数据信息丰富等优点，所以常被研究者用来构建物种系统树，阐释物种间的亲缘关系以及物种的鉴定。本研究用于分析的ITS序列有64条，其中5条为GenBank中下载获得（表2、 图 1）。

图1 基于ITS序列构建的云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌7棵最大简约树之一

根据系统树的拓扑结构，云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌形成5个较大的分支。Clade I中的种是云南鲜菇市场和干片商品中易见的混杂种类，涉及裘氏牛肝菌属[10]、圆孔牛肝菌属、条孢牛肝菌属、金牛肝菌属、松塔牛肝菌属和牛肝菌属共6个属，这6个属，除了牛肝菌属外，其余5个属的牛肝菌资源在地方上，没有人将新鲜子实体直接炒食，老百姓都说有毒，其中Subclade I是最大的混杂类群，流入市场的主要原因是绿盖裘氏牛肝菌资源量丰富，采集容易，加之当地老乡认为鲜食有毒，但加工成干片，可以去掉毒素；其次SubcladeⅡ中的亚绒盖牛肝菌（B.subtomentosus）是否有毒说法不一，市场上少见新鲜子实体出售，此菌在各地没有人鲜食，一般主要以干片的形式混杂于小美牛肝菌和美柄牛肝菌中出售；另外，Subclade III中的混淆松塔牛肝菌（Strobilomyces confusus）也主要以干片混杂出售。CladeⅡ分支中的牛肝菌种类主要以内销为主，如双色牛肝菌（B.bicolor）是品质优良的食用菌，市场价值高，茶褐牛肝菌（B.brunneissimus）是滇中地区商品量较大的食用菌；在这个分支中也存在一些食毒说法不一的种类[1，11，12]，如赭黄牛肝菌 （B.luridus） 和红柄牛肝菌（B.erythropus）。Clade III分支中涉及到的种类是属于美味牛肝菌复合群，产量大，市场价值高，在采集和销售中往往当作美味牛肝菌一个种来处理。在Clade IV中，紫牛肝菌（B.violaceo-fuscus）的食用性存在争议，在一些地区（如宜良县）老百姓说是毒菌，不宜采食，而在另一些地区（如南华县）有人认为可食，但未见单独加工食用，常常是采集或收购加工成干片后混杂于其它牛肝菌中销售。另外，紫牛肝菌（B.violaceo-fuscus）与牛肝菌属（Boletus）其它种的亲缘关系较远，所以紫牛肝菌是否属于牛肝菌属值得进一步研究。CladeⅤ中涉及的种，主要用于盐渍或干片，特别是小孢粉孢牛肝菌（T.microsporus）量大[10]，价格便宜，但在当地没人食用。

2.2 云南商品牛肝菌中易混淆毒菌种类

云南多元的立体气候，为各种牛肝菌的生长提供了良好的生境，培育了繁荣的野生菌市场，经形态学与分子生物学结合研究发现，云南商品牛肝菌资源量大，约占野生菌交易量的1/3；物种多样性丰富，至少涉及16个属；市场上常见易混淆的有毒牛肝菌有绿盖粉孢牛肝菌（Chiua virens）、圆花孢牛肝菌（Heimioporus retisporus）、黄粉末牛肝菌（Pulveroboletus ravenelii）、紫盖牛肝菌（Tylopilus eximius）和小孢粉孢牛肝菌（Tylopilusmicrosporus）共5种。

3 讨论

云南特殊的生境资源，孕育了丰富的大型真菌资源。种类多、生态复杂使得云南牛肝菌生物多样性丰富，种间形态相似性较高，这给采菌者和消费者正确识别带来较大困难。目前，国内外还没有一种科学快速鉴定或检测所采或所食牛肝菌是否为毒菌的方法或技术，所以人们判断一种牛肝菌是否有毒的主要依据来源于文献和当地有采菌经验者的认识。但是，有时不同文献对同一物种的可食性报道说法不一致，导致在信息的取舍上难以抉择；有时还出现文献之间[2，12]、文献与实际食用之间矛盾的情况，如美柄牛肝菌（B.calopus）和小美牛肝菌（B.speciosus）文献报道有毒，而这两个种市场量大，消费人群广，老百姓和消费者都说是安全的无毒菌，另外，老百姓 “以貌择食”的传统识别方法对某一种毒菌可以，但不能用作区分所有毒菌的一般规律，如双色牛肝菌颜色艳丽却是美味食用菌，而小孢粉孢牛肝菌颜色普通则为毒菌。

从以上的分析可以看出，目前尚无统一或简单有效识别毒牛肝菌的方法，这给牛肝菌可食性判断带来很大影响，特别是市场上的少见种，因此在确定某一种牛肝菌是否可食时，必须多走访调查有采集经验的人，经他们确认可食时，方可确认无毒。

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