NF-kB在腹腔镜术后非切口疼痛中的表达及其意义

陈 前，刘维燕，江道文

(上海瑞金医院集团闵行区中心医院 普外科，上海 201100)

腹腔镜自应用于医学以来，与常规开腹手术相比，其微创性已得到了公认。但微创不等于无创。由于CO2气腹之特殊性，因此，腹腔镜有其特有的并发症。临床资料显示［1～3］，高达35% ～80%患者腹腔镜CO2气腹后出现非切口疼痛，成为腹腔镜手术后病人最主要的不适主诉。至今国内外有关腹腔镜非切口疼痛的原因尚未阐明，特别是对与CO2直接接触的腹膜自身的细胞分子改变及机制方面研究较少;目前实验已证实NF-kB的激活是外科应激反应中重要的早期事件，NF-kB表达与急性损伤密切相关;CO2气腹引起腹膜创伤反应过程中，可能存在腹膜NF-kB的激活和高表达，从而导致细胞因子及PG类产物的联级反应，这可能是CO2气腹后非切口疼痛产生的重要机制;若能在一定水平抑制NF-kB的激活和高表达，将可能为腹腔镜术后非切口疼痛的临床防治开辟崭新的途径。我们采集腹腔镜CO2气腹腹膜组织，检测 NF-kB，探讨腹膜 NF-kB与非切口疼痛的关系。

1 资料与方法

1.1 选取腹腔镜胆囊切除手术病例40例，患者中男性22例，女性18例。年龄36～73岁，平均(50.5±9.1)岁;随机分为两组，每组20例:A组(常规腹腔镜手术);B组(乌斯他丁+腹腔镜手术);另设C组(开腹胆囊切除手术)，20例。

1.2 人工气腹建立 腹腔镜胆囊切除术中常规建立CO2人工气腹，气腹压力为12 mmHg。所有手术均由本科两位医生完成，均受过正规的腹腔镜手术和外科手术操作训练。

1.3 NF-kB mRNA 表达量 试剂:Trizol，dNTP mix，10 ×PCR Buffer，TaqDNApolymerase等购于上海生物工程技术有限公司。仪器:2400型PCR仪(英国TECHNE公司)、DY2501 B型电泳、H621微型电泳槽(上海琪特分析仪器有限公司)、GIS-2008凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.4 术后采用视觉模拟评分法(VAS)，观察患者手术12 h后非切口疼痛如膈下及肩端疼痛、腹部胀痛等症状。

标本采集:A组、B组分别于手术结束，排放CO2人工气腹之前，取腹膜组织标本4块，立即存放液氮罐保存;所获组织采用荧光定量聚合酶链反应法(荧光定量PCR)测定NF-kB mRNA表达量变化;C组(开腹手术)于开腹1 h时取腹膜组织标本，方法同上。

NF-kB mRNA检测方法:总RNA提取严格按RNA纯化系统试剂盒操作说明书进行;NF-kB的扩增为上游引物:5'-AGTTTGACGGTCGTGAGC-3'，下游引物:5-TGTGGGTAGGATTTTCTTGTT-3';内参基因GAPDH的扩增为上游引物:5'-TACTAGACAAGATGGTGAAG-3'，下游引物 5'-TGACGGGATC TCGTCCCTGGAAGAT-3';反应条件:PCR预变性(5 min，95 ℃);变性(30 s，95 ℃)，退火(30 s，59 ℃)，聚合(30 s，72℃);延伸(10 min，72℃)。其中变性、退火和聚合共进行33个循环;PCR扩增在荧光定量PCR仪上进行;然后将两种扩增产物分别注入琼脂糖凝胶上电泳，GIS-2008凝胶成像系统分析电泳产物，计算目的基因与相应内参的比值，以此作为该目的基因mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 一般情况分析 A组男性12例，女性8例，年龄(49.9±9.9)岁;B 组男性10例，女性10例，年龄(50.1±9.6)岁;两组间性别和年龄无显著性差异(P＞0.05);A组建立CO2人工气腹时间为(45±15)min;B组建立CO2人工气腹时间为(46±14)min，无显著性差异(P ＞0.05)。

2.2 NF-kB mRNA 表达 NF-kB mRNA 在各组腹膜组织中均有不同程度的表达，但腹腔镜组比对照开腹组为高(P＜0.05)。与A组相比，B组NF-kB mRNA的表达明显下降 (P＜0.05)，见表1。

表1 NF-kB表达量(灰度)

2.3 非切口疼痛 腹腔镜CO2气腹后，非切口疼痛发生部位以膈下及肩端疼痛、腹部胀痛等为主，发生率为75%，VAS评分6.1;NF-kB抑制剂乌斯他丁能在一定水平，降低CO2气腹后非切口疼痛的发生几率(发生率为30%)，减轻CO2气腹后非切口疼痛的程度(VAS评分3.1)，A、B组有显著差异(P＜0.05)。A、B组非切口疼痛的发生几率、VAS评分均较C组高，有显著差异(P＜0.01)。见表2。

3 讨论

临床资料显示，高达35%～80%患者腹腔镜CO2气腹后出现非切口疼痛如膈下及肩端疼痛、腹部胀痛等，有时相当明显，其程度和持续时间上常常超过伤口疼痛，成为腹腔镜手术后病人最主要的不适主诉。目前采用术中更换气体、放置引流管、注射局麻药、术终吸净腹内气体、于术前术中术后经肌肉或静脉注射止痛药、联合麻醉等方法防治非切口疼痛［3，4］，但这些方法都有其局限性，效果不佳。至今国内外有关腹腔镜非切口疼痛的原因尚未阐明，是否与CO2直接接触的腹膜中分子如核转录因子-kB(NF-kB)高表达有关，这方面的文献报道极少，亟待进一步研究。

表2 术后非切口疼痛发生情况

人体腹膜由间皮细胞和少量的细胞间质组成，是单层扁平组织;间皮细胞呈扁形，细胞边缘互相嵌合，上皮细胞间连接紧密，不易分离，其间仍有小间隙。间皮细胞间还有成纤维细胞、巨噬细胞、浆细胞和肥大细胞等。CO2气腹后非切口疼痛是否与腹膜的损伤有关，正引起关注。有学者通过动物模型研究气腹与腹膜创伤的关系，发现气腹后腹膜表浅层发生显著变化，腹膜超微结构改变主要表现在间皮细胞形态学改变及其连接断裂以及基底膜的表现。Suematsu等［5］报告腹腔镜腹膜的电镜下改变，可见腹膜间皮细胞肿胀及其间连接明显断裂，深及基底膜，胞间隙出现。刘彦等［6］研究发现，气腹造成了腹膜间皮细胞形态改变，间皮细胞连接明显断裂并深及基底膜下，细胞连接的完整性和腹膜的微观解剖结构，遭到暂时性破坏，而且与充气时间有关。

NF-kB与创伤密切相关，它在创伤后的炎症、免疫反应和创伤后的修复中通过调节相关靶基因的转录而起着重要作用，是近年来外科应激反应中研究的热点。研究表明细胞因子的瀑布样级联反应在器官损害中起着重要的作用，NF-kB是细胞因子释放的开关，在急性炎症反应机制中起着重要作用［7，8］。新近学者发现一种新的蛋白酶抑制剂GDSP(guamerin-derived synthetic peptide，Guamerin源性合成肽)可以显著抑制NF-kB的活性。其作用以乌斯他丁为代表，乌斯他丁是一种从人的尿液中提取出来的蛋白多肽，也是一种NF-kB抑制剂，不但在动物模型上取得了满意的结果，在临床应用中也得到了肯定的疗效。本课题通过选取腹腔镜手术病例，研究发现，腹腔镜CO2气腹后非切口疼痛发生部位以膈下及肩端疼痛、腹部胀痛等为主，A组非切口疼痛发生率为75%，共计15例(包含患者同时有多部位的疼痛)，VAS评分6.1;NF-kB mRNA 在各组腹膜组织中均有不同程度的表达，A组、B组均较C组表达更为明显(P＜0.05);CO2气腹引起腹膜创伤反应过程中，CO2气腹改变了腹膜形态学;并且随充气时间延长，这种改变更加明显。CO2气腹对腹膜NF-kB表达有促进作用，存在腹膜NF-kB的激活和高表达，从而导致细胞因子及PG类产物的联级反应，这可能是CO2气腹后非切口疼痛产生的重要机制;本课题中B组非切口疼痛、腹膜组织中NF-kB mRNA等指标均较A组明显下降，这说明NF-kB抑制剂乌斯他丁能在一定水平抑制NF-kB的激活和高表达，减轻腹膜损伤，减轻应激反应，减轻CO2气腹后非切口疼痛的程度，降低CO2气腹后非切口疼痛的发生几率。

CO2气腹对腹膜NF-kB激活可能是引起CO2气腹后非切口疼痛的原因之一，腹膜NF-kB可作为评价CO2腹腔镜术后腹膜创伤反应程度的指标之一，NF-kB的阻断剂可减轻CO2腹腔镜术后腹膜的创伤反应和非切口疼痛。

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