HPLC 法同时测定复合维生素口服液中4种水溶性维生素的含量

白靖，向柏，申磊，何朝星，张贵琴，曹德英（河北医科大学药学院，石家庄市050017）

维生素是维持人体健康所必需的营养元素[1]，有利于促进和平衡体内组织的新陈代谢，被广泛用于临床治疗、辅助治疗及日常营养、保健。目前，复方维生素类制剂占据了相当大的市场，因此关于维生素测定方法的研究越来越值得关注。液质联用技术[2]的引入，将色谱的分离能力与质谱的定性功能相结合，提高了微量元素的检测灵敏度和精准度，然而此方法高成本的缺点限制了其普及应用。因此，如何运用常规的维生素测定方法，无论是紫外分光光度法[3]、荧光分光光度法[4]，还是高效液相色谱（HPLC）法[5，6]，简便、准确、高效地测定多种维生素，已成为复方维生素制剂质量控制研究的重要手段。

复合维生素口服液为河北医科大学药剂教研室自制保健产品，旨在将脂溶性维生素与水溶性维生素相结合，其主要成分为维生素A、维生素D3、维生素E、右泛醇、维生素B1、维生素B2磷酸酯钠、烟酰胺、维生素B6等，可为人体提供全方位的营养支持，用于营养不良及临床辅助治疗。目前关于维生素B1、维生素B2磷酸酯钠、烟酰胺、维生素B64种水溶性维生素的含量测定方法，大多采用HPLC法，应用流动相梯度洗脱方式[7]，样品处理烦琐，测量时间较长，且往往仅限于分析水溶性维生素组成的复方制剂。本研究在摸索复合维生素口服液中多组分维生素含量测定方法时，建立了方便的等度反相HPLC法同时测定制剂中维生素B1、维生素B2磷酸酯钠、烟酰胺和维生素B6的含量，实现了在脂溶性维生素并存的情况下分析目标水溶性维生素，而且每个样品进样前只需用水稀释，分析时间小于15 min。该法简便、快速、准确、重复性好，大大缩短了测量时间，有利于生产过程中该类产品的质量控制。

1 仪器与试药

Lab Alliance Model 500 HPLC仪（美国Lab Alliance公司）；BP211D型电子分析天平（德国Satorius公司）；复合维生素口服液（自制，批号：20100301、20100302、20100303，规格：每支10 mL，含维生素B1100 mg、维生素B2磷酸酯钠70 mg、烟酰胺350 mg和维生素B630 mg）；己烷磺酸钠（天津傲然精细化工研究所，批号：20071116，纯度：≥99.0%）；烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠（核黄素磷酸钠）标准品（中国药品生物制品检定所，批号分别为：100115-200302、100116-200502、100390-200502、100283-200501，纯度：均大于99.0%）；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯；水为二次纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：己烷磺酸钠溶液（1 g→690 mL水）-甲醇-冰醋酸（690∶303∶7，V/V/V）；流速：1 mL·min－1；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液。精密称取烟酰胺875 mg、维生素B675 mg、维生素B1250 mg和维生素B2磷酸酯钠175 mg，同置于250 mL容量瓶中，加水100 mL使溶解，再用水稀释至刻度，摇匀。精密量取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。

2.2.2 供试品溶液。将复合维生素口服液摇匀，精密量取2.5 mL，置于250 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取标准品溶液及供试品溶液各20 μL注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，记录色谱，详见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

由图1可见，在上述色谱条件下，含有脂溶性维生素的复合维生素口服液中的烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠能得到很好的分离。

2.4 线性关系考察

精密称取标准品烟酰胺875 mg、维生素B675 mg、维生素B1250 mg和维生素B2磷酸酯钠175 mg置于同一100 mL容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（c，μg·mL－1）为横坐标进行线性回归，相关结果见表1。

表1 各组分线性关系考察结果Tab 1 Results of linear ranges for 4 kinds of vitamins

表1结果表明，各组分在相应的浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠峰面积值的RSD分别为0.5%、0.6%、0.6%和0.9%（n＝6），表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取本品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液（冷处贮藏），按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8 h进样，记录峰面积。结果，烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠峰面积值的RSD分别为0.7%、0.6%、1.2%、1.9%（n＝5），表明溶液在8 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密量取本品，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，照“2.1”项下色谱条件进样。结果，烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠峰面积值的RSD分别为0.7%、0.8%、0.7%、1.3%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

分别按处方量的80%、100%、120%精密称取烟酰胺，按处方比例称取其他主药及辅料制备成低、中、高浓度（280、350、420 μg·mL－1）的样品溶液各3份，按“2.1”项下色谱条件进样，计算回收率；同法测定维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠的回收率。结果烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠的平均回收率分别为101.3%（RSD＝1.7%，n＝9）、99.5%（RSD＝1.5%，n＝9）、100.0%（RSD＝1.9%，n＝9）和98.4%（RSD＝2.0%，n＝9）。

2.9 样品含量测定

取3批复合维生素口服液，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。取标准品与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算样品浓度，结果详见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2Results of content determination in samples（n＝3）

3 讨论

本试验在流动相组成考察时，发现在甲醇的基础上加入少量冰醋酸，指标成分峰形和分离效果有明显改善；同时发现，离子对试剂己烷磺酸钠的加入，能有效改善主峰的分离度，且流动相中己烷磺酸钠溶液与甲醇的比例对主峰分离效果影响较大，最终确定己烷磺酸钠溶液与甲醇的比例为690∶303（V/V）。本文使用己烷磺酸钠作离子对试剂，用简单的等度洗脱方式即可实现对4种水溶性维生素的分离，而且脂溶性维生素组分及辅料对其测定无干扰；整个样品的分析时间仅为15 min，大大提高了分析效率。同时，试验证明，样品进样前只需用水稀释，即可满足指标成分的检测，既降低了成本，又避免了操作上的烦琐，有利于实际生产过程中大量产品的分析测定。

考虑到维生素对氧、光、热、金属离子敏感[8]，建议本品密封、避光、冷处保存，且供试品溶液制备后尽快分析测定。

本试验建立的HPLC法能够同时测定烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2磷酸酯钠4种维生素成分的含量，且方法简便、快速、准确、重复性好，为含有上述维生素类成分的多维复方制剂及保健产品的质量控制提供了参考。

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