肝脏X受体激活对α-GalCer诱导的小鼠肝损伤保护机制探讨*

刘 渊 卞兆连 韩小凤 王绮夏 邱德凯 马 雄

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所（200001）

自身免疫性肝炎（AIH）是由异常自身免疫反应介导的肝实质炎症性病变，以高丙种球蛋白血症、血清自身抗体阳性和对免疫抑制治疗有应答为特点[1,2]，其病因和发病机制目前尚不清楚。大量研究发现AIH患者肝脏内有大量激活的淋巴细胞浸润，并分泌高水平促炎细胞因子，这些淋巴细胞和炎症介质在肝脏炎症损伤过程中起重要作用[3]。α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）为不变型Vα14自然杀伤T细胞（NKT细胞）的特异性配体，可诱导免疫介导的肝损伤小鼠模型，模型小鼠血清转氨酶水平升高，肝小叶内大量炎性细胞浸润，肝细胞变性坏死，其特点与人类AIH极为相似。研究[4]发现予C57BL/6小鼠注射α-GalCer可诱导明显的细胞因子反应，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6 等。

肝脏X受体（LXR）属于核受体超家族成员，对脂类代谢相关基因的转录调控起关键作用。近年研究发现LXR还具有调节免疫反应和抗炎效应。在接触性皮炎、动脉粥样硬化、自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中，LXR激动剂可有效抗炎、抑制炎症基因表达，调节免疫反应[5 ～ 7]。本研究通过观察LXR激动剂对α-GalCer诱导的小鼠肝损伤的影响，探讨LXR激活对肝损伤的保护作用及其可能机制，为进一步了解AIH的发病机制、探索AIH的潜在治疗靶点提供实验依据。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

雄性清洁级C57BL/6J小鼠15只，6 ～ 8周龄，体质量18 ～ 22 g，由中科院上海实验动物中心提供，饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部实验动物饲养中心。标准商业饲料购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

LXR激动剂T0901317（Cayman Chemical Company），α-GalCer Analog 7（AXXORA®Platform），即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒（福州迈新生物技术开发公司），羊抗鼠IL-6多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.），蛋白抽提试剂盒（碧云天生物技术研究所），小鼠 Akt、p-Akt、IκBα、p-IκBα、PI3K （p85）、NF-κB （p65）抗 体 （Cell Signaling Technology,Inc.），TRIzol®试剂（InvitrogenTMby Life Technologies），PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR®Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）（TaKaRa Bio Inc.）。

二、方法

1.动物分组和模型制备：小鼠随机分为3组，分别为正常对照组、α-GalCer模型组和LXR治疗组，每组5只。

T0901317预先溶于DMSO，浓度为50 mg/ml，－20℃保存，使用前以0.9%NaCl溶液稀释至3 mg/ml[8]。 α-GalCer预先溶于 DMSO，浓度为 1 mg/ml，－20℃保存，使用前以含0.5%Tween-20的1×PBS稀释至6μg/ml[9]。LXR治疗组每天腹腔注射T0901317（30 mg/kg），注射体积为 0.3 ml，另两组注射等体积溶剂，连续注射 7 d；第 8 d，α-GalCer模型组和LXR治疗组腹腔注射α-GalCer（40μg/kg），注射体积为0.2 ml，正常对照组注射等体积溶剂。α-GalCer腹腔注射6 h后眼眶取血0.8 ～ 1.0 ml，处死小鼠，于肝脏右叶相同部位留取肝组织，用于后续实验。

2.肝脏组织病理学检查：肝组织4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察。

3.血清转氨酶水平检测：以HITACHI 7080全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平。

4.免疫组化染色检测IL-6表达：甲醛固定石蜡包埋肝组织4μm厚连续切片，常规脱蜡至水，3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性，微波抗原修复，封闭液室温封闭，滴加IL-6抗体（1:100），4℃过夜，滴加二抗，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。拍照后以Image-Pro Plus 6.0软件分析肝组织IL-6阳性物质单位面积内的积分光密度值（IOD），作为IL-6蛋白相对表达量。

5.蛋白质印迹法检测PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活情况：抽提肝组织总蛋白，测定蛋白浓度。电泳，转膜，封闭，依次一抗、二抗孵育，ECL显影，定影。扫描图像，ImageJ 1.42软件分析肝组织各目的蛋白相对表达量。

6.实时荧光定量RT-PCR检测TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达：抽提肝组织总RNA，逆转录合成cDNA，以之为模板行实时荧光定量PCR，引物设计采用Primer Express软件（见表 1）。PCR 循环参数：95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，60 ℃20 s，81 ℃ 1 s，45 个循环。以 β-actin 为内参照，2－△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。以正常对照组表达量为基数，将α-GalCer模型组和LXR治疗组的表达量转换成与正常对照组的比值表示。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

三、统计学分析

结 果

一、LXR激活减轻α-GalCer诱导的肝损伤

正常对照组肝组织结构正常，未见明显淋巴细胞浸润和肝细胞坏死；α-GalCer模型组肝组织门管区和小叶内大量淋巴细胞浸润，肝细胞肿胀坏死明显；LXR治疗组肝组织淋巴细胞浸润程度明显轻于α-GalCer模型组，偶见肝细胞坏死（见图1）。各组血清ALT、AST水平的变化与肝组织病理学改变平行，α-GalCer模型组显著高于正常对照组，LXR治疗组则较α-GalCer模型组显著降低（见表2）。

表2 各组血清转氨酶水平比较（x±s,U/L）

二、LXR激活下调肝组织IL-6表达

免疫组化染色显示，IL-6阳性物质呈棕黄色，主要定位于细胞质。α-GalCer模型组IL-6主要表达于肝细胞中，肝组织IL-6表达量较正常对照组显著上调（6512.23±356.74 对 98.17±38.59,P<0.01），LXR 治疗组（501.46±79.84）则较 α-GalCer模型组显著下调（P<0.01）（见图 2）。

三、LXR激活抑制肝内PI3K/Akt/NF-κB信号通路

蛋白质印迹法检测显示，各组间肝组织总Akt、 总 IκBα 蛋白表达量无明显差异，α-GalCer模型组 PI3K p85、p-Akt、p-IκBα、NF-κB p65 蛋 白表达量较正常对照组显著上调，LXR治疗组则较α-GalCer模型组显著下调（见表3、图3）。

四、LXR激活下调肝组织TNF-α、iNOSmRNA表达

实时荧光定量RT-PCR检测显示，α-GalCer模型组肝组织TNF-α、iNOSmRNA表达量较正常对照组明显上调，LXR治疗组则较α-GalCer模型组显著下调（TNF-α:2.19±1.34 对 7.31±3.78,P<0.05;iNOS:2.65±1.21 对 5.12±0.67,P<0.05）。

表3 各组肝内PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白表达量比较（±s ）

表3 各组肝内PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白表达量比较（±s ）

*与正常对照组比较，P<0.01；与 α-GalCer模型组比较，△P<0.05，▲P<0.01

组 别 例数 PI3K p85 p-Akt 总Akt p-IκBα 总IκBα NF-κB p65正常对照组 5 0.30±0.02 0.26±0.03 1.00±0.07 0.11±0.01 0.76±0.02 0.37±0.02 α-GalCer模型组 5 0.86±0.01* 0.67±0.05* 1.08±0.07 1.08±0.02* 0.80±0.01 0.89±0.01*LXR 治疗组 5 0.75±0.02△ 0.46±0.02▲ 0.99±0.08 0.83±0.01▲ 0.81±0.01 0.72±0.07△

图3 各组肝内PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白蛋白质印迹法电泳图

讨 论

AIH的病因和发病机制至今尚未明确。AIH患者肝脏具有典型的界面性肝炎特征，门管区有大量淋巴细胞浸润，并有较高水平的促炎细胞因子分泌，表明肝内免疫反应引起的炎症可能在AIH的发生、发展过程中起关键作用[10]。因此，通过免疫调节抑制肝脏炎症成为治疗AIH的重要途径之一。

理想的动物模型对AIH的研究具有重要意义。伴刀豆球蛋白A（Con A）模型和α-GalCer模型均为经典的免疫介导肝损伤小鼠模型。然而，Con A模型的肝脏炎症并非由自身抗原所诱导，α-GalCer则可作为天然自身抗原的替代抗原被MHC-Ⅰ样分子CD1d呈递至NKT细胞[4]。因此α-GalCer模型与Con A模型相比更接近人类自身免疫性肝病，是研究AIH理想的动物模型。

LXR系于1994年从肝cDNA文库克隆得到，因在肝脏内大量表达而得名，包括LXRα（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）两种亚型。LXRα和LXRβ在组织分布上有一定差异，LXRα在肝脏内高表达，在肾上腺、肠、脂肪组织、巨噬细胞、肺、肾等部位亦有一定水平的表达，LXRβ则在全身广泛表达。除参与调控胆固醇的吸收、输出、转运、分泌等过程，LXR对免疫和炎症反应亦具有调节作用[11]。研究发现LXR 激活可抑制 Toll样受体 4（TLR4）、IL-1β、TNF-α等介导的信号通路及其下游炎症基因表达，可由LXR激动剂抑制的参与免疫反应的炎症介质、细胞因子、趋化因子等基因包括iNOS、环氧合酶-2（COX-2）、IL-6、IL-1β、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、MCP-3、巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等[6]。T0901317是人工合成的LXR选择性激动剂，可以同时激活LXRα和LXRβ。LXR激动剂已在多个自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎、胶原性关节炎动物模型中被证实可减轻症状、改善炎症[12,13]，然而关于LXR激活对肝脏自身免疫性炎症性疾病的保护作用及其机制的研究尚少。本研究首次在α-GalCer诱导的小鼠肝损伤模型中证实LXR激活可调节免疫反应，抑制肝脏炎症，从而发挥肝脏保护作用。

血清转氨酶活性升高是AIH重要的临床生化指标，在一定程度上可反映肝损伤的严重程度[14]。本研究发现LXR激活能显著降低腹腔注射α-GalCer引起的血清ALT、AST水平升高，组织病理学检查示α-GalCer模型组小鼠肝内大量淋巴细胞浸润，肝细胞肿胀坏死明显，而LXR治疗组小鼠的淋巴细胞浸润程度明显轻于α-GalCer模型组，仅偶见肝细胞坏死，证实肝损伤程度与血清转氨酶水平的变化相一致。

IL-6为Th17型细胞因子，在肝脏中可由单核细胞、巨噬细胞、肝细胞等产生，是一种促炎细胞因子。研究[15]显示AIH患者血清IL-6水平显著升高，并与肝脏炎症相关。Th17细胞可诱导肝细胞表达IL-6，而IL-6进一步作用于Th17细胞，形成正反馈，这可能是AIH的发病机制之一。本研究中小鼠腹腔注射α-GalCer后肝细胞IL-6表达显著上调，而LXR激活可显著下调α-GalCer引起的肝细胞IL-6分泌，从而调节免疫反应，抑制肝脏炎症。

研究表明PI3K/Akt信号通路可负反馈调节过度的先天免疫和TLR介导的促炎反应[16]，可能与自身免疫性疾病有关[17]，但该信号通路与AIH之间有无联系尚无相关报道。PI3K/Akt信号通路激活可诱导IκBα磷酸化，使 NF-κB p65亚基与之解离并向核内易位，从而激活NF-κB的转录活性，启动一系列免疫、炎症反应相关细胞因子基因表达。本研究发现α-GalCer腹腔注射可激活肝内PI3K/Akt信号通路，肝组织PI3K、p-Akt表达明显上调，p-IκBα、NF-κB p65 同时上调，而 LXR 激活可显著下调α-GalCer引起的上述蛋白表达上调，提示LXR激活可抑制PI3K/Akt信号通路的激活，通过抑制IκBα磷酸化而影响NF-κB的转录活性，从而减少促炎细胞因子表达，抑制肝脏炎症，起到保护肝脏的作用。

TNF-α是介导α-GalCer诱导的肝损伤的重要介质，以抗体中和TNF-α可显著减轻α-GalCer诱导的肝损伤[4]。TNF-α可通过NF-κB信号通路诱导iNOSmRNA和蛋白表达[18]，而iNOS催化产生的一氧化氮（NO）可介导肝损伤。本研究证实LXR激活可显著下调α-GalCer腹腔注射引起的肝组织TNF-α、iNOSmRNA表达上调，从而减轻肝损伤。

综上所述，以LXR激动剂T0901317激活LXR可调节免疫反应，抑制肝脏炎症，从而显著减轻α-GalCer诱导的小鼠肝损伤，提示LXR激动剂对AIH具有潜在治疗价值。LXR激活对肝脏的保护机制可能与抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活有关。

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