兔抗人TGF-β1多克隆抗体的制备

郭 冉，刘洁婷，吴 丹，徐秋玲，初彦辉※

(1.牡丹江医学院生理教研室，黑龙江牡丹江157011;2.黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江牡丹江157011)

转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是目前已知的与瘢痕形成关系最为密切的细胞因子，研究最为广泛［1，2］。它既可以促进细胞外基质的合成又可以抑制其降解。在创伤中TGF-β1的表达增加，同时还能刺激成纤维细胞产生内源性TGF-β1，甚至加入外源性的TGF-β1可以增加创伤中胶原纤维蛋白和炎性细胞的数量［3］。陈永平等［4］曾提出将TGF-β1构建为疫苗，刺激机体产生抗体，中和体内产生的过量的 TGF-β1。相关文献报道，抗TGF-β1抗体具有中和 TGF-β1活性的作用［5］，抗TGF-β1抗体能明显抑制成纤维细胞的超微结构，能抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成［6］。

1 材料与方法

1.1 材料 人重组TGF-β1蛋白由黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室提供;雄性新西兰白兔2只，4.5～5 个月龄，体质量(2.2 ±0.2)kg。购自黑龙江省中医药大学动物中心。可拆卸酶标板为Corning公司生产。弗氏不完全佐剂(Freunds adjuvant，incomplete)、弗氏完全佐剂 (Freunds adjuvant，complete)购自 Sigma公司。3，3，5，5-四甲基联苯胺盐酸盐购自AMRESCO公司。UPS-蛋白质银染试剂盒由温州安得森生物科技有限公司惠赠;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原乳化 用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，pH=7.4)将 TGF-β1蛋白稀释至1 μg/L，按体积比1∶11加入弗氏佐剂，混合至乳状，待成为乳白色黏稠的油包水乳剂时，将佐剂抗原滴入冰水表面，滴入后10 min应保持完整而不分散时，即为合格［7］。

1.2.2 免疫动物 动物免疫前，由耳缘静脉取血5 mL，分离血清，置－20℃保存，作为阴性对照。取充分乳化后蛋白，皮下多点注射新西兰白兔，每只用量为0.5 mg;14 d后用弗氏不完全佐剂加强免疫1次。共加强免疫3次，后两次加强免疫直接静脉注射不含佐剂的抗原0.5 mg。第21天开始耳缘静脉取血检测效价，末次免疫7 d后颈总动脉采血收集抗血清，分装后－80℃保存。

1.2.3 纯化多克隆抗体 采用饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化抗体［8］。①取兔血清10 mL与等体积生理盐水混合后，于搅拌下缓慢滴加饱和硫酸铵20 mL，于4℃缓慢搅拌3～4 h，使蛋白充分沉淀。②4℃离心，3000 r/min，30 min，弃上清，用 6 mL 生理盐水溶解沉淀，缓慢滴加4 mL饱和硫酸铵，4℃缓慢搅拌1 h。重复②步。③4℃离心，用6.7 mL生理盐水溶解沉淀，滴加3.3 mL饱和硫酸铵，4℃缓慢搅拌1 h。重复③步。④4℃离心，用磷酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH=7.4)2 mL溶解沉淀，磷酸盐缓冲液(10 mmol/L)透析，更换3次磷酸盐缓冲液，4℃缓慢摇动过夜，得到抗血清，分装后置－20℃保存备用。

1.2.4 检测多克隆抗体的效价 将TGF-β1重组蛋白用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.6)稀释成0.025 μg/L，每孔100 μL 体积包被反应板，4℃过夜;37℃封闭2 h，再4℃过夜;将纯化后多抗兔血清用磷酸盐缓冲液(10 mmol/L)倍比稀释(1∶1200～1∶125 600)，同时取免疫前血清1∶1500稀释，作为阴性对照。每组3个复孔。每孔100 μL体积加入反应孔中，37℃，1 h;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体稀释液 100 μL(1∶14 000)，37℃，1 h;加入3，3，5，5-四甲基联苯胺盐酸盐工作液 100 μL，于37℃避光显色15～30 min;加入2 mol/L H2SO4终止反应;酶标仪450 nm波长检测各孔OD值。P/N值=(A样品-A空白对照)/(A阴性样品-A空白对照)，P/N值≥2.1判为阳性，反之则为阴性。阳性反应的最大稀释度即为待测样品的效价［9］。

1.2.5 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体 取纯化后的抗血清，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)检测，确定纯化后抗血清中免疫球蛋白的含量以及纯化的效果。

1.2.6 Western blot检测抗体 取人重组TGF-β1蛋白10 μL，以纯化后的兔抗人TGF-β1多克隆抗体作为一抗(1∶110 000)，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体作为二抗，进行Western blot检测抗体的特异性。

2 结果

2.1 多克隆抗体效价测定 间接酶联免疫吸附试验测得纯化后抗体效价为1∶112 800。

2.2 SDS-PAGE检测抗体 纯化后的抗血清经还原型SDS-PAGE检测，结果如图1，主要蛋白条带在约50×103位置，符合兔免疫球蛋白基本特征，另外，在20×103左右出现较弥散的条带，为免疫球蛋白轻链分子。

图1 SDS-PAGE分析多克隆抗体

图2 免疫印迹分析多克隆抗体

2.3 Western blot检测抗体 以纯化后的多克隆抗体作为一抗，与人重组TGF-β1蛋白进行Western blot免疫印迹分析，结果如图2所示。结果表明，多克隆抗血清与TGF-β1蛋白分子量位置发生反应，说明制备的多克隆抗体能与目的蛋白特异性结合。

3 讨论

抗 TGF-β1抗体，作为 TGF-β1有效的拮抗剂，能竞争性抑制TGF-β1与其受体结合，阻断其生物活性，从而避免或者减轻TGF-β1对机体产生的不利影响，并对各种器官的纤维化治疗起到一定的作用。一些研究TGF-β与瘢痕形成的关系发现，应用抗TGF-β抗体可能会减轻瘢痕。Shah等［10］的研究显示，在成年大鼠皮下局部注射TGF-β1和TGF-β2抗体可降低TGF-β的水平，减少单核细胞、巨噬细胞的数量，减少Ⅰ型和Ⅱ型胶原的沉积，结果瘢痕显著减少。经抗体处理后的动物模型伤口，其胶原的沉积、巨噬细胞和血管的增生等均比对照组减少，其张力和皮肤结构则与对照组一致。在创伤早期应用抗TGF-β 抗体对降低 TGF-β 水平，避免 TGF-βmRNA自我诱导，限制巨噬细胞增生和TGF-β的释放具有重要作用。

目前，对 TGF-β抗体的研究多为体外实验，且TGF-β抗体成品比较昂贵，使其应用受到限制。本实验以TGF-β1蛋白作为抗原，在动物体内制备多克隆抗血清。经饱和硫酸铵盐析法纯化后，间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价达1∶110 000以上。SDS-PAGE分析及Western blot检测，本研究所获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体纯度较高，能与TGF-β1目的蛋白特异性结合。为进一步研究与TGF-β1密切相关的疾病，特别是抗纤维化的研究提供了有利条件，奠定了物质基础。

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［6］李宜姝，郝立君，苏海涛.抗转化生长因子β1(anti-TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响［J］.黑龙江医学，2002，26(9):657-659.

［7］Wong VS，Hughes V，Trull A，et al.Serum hyaluronic acid is a useful marker of liver fibrosis in chronic hepatitis C virus infection［J］.J Viral Hepat，1998，5(3):187-192.

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［10］Shah M，Foreman DM，Ferguson MWJ.Neutralising antibody to TGF-beta 1，2 reduces cutan-eous scaring in adult rodents［J］.J Cell Sci，1994，107:1137.