全量采样的他克莫司群体药代动力学分析*

郁俊德，叶红波，陈文瑛，芮建中**

1苏州市木渎人民医院药剂科，苏州 215101；2南京军区南京总医院药理科，南京 210002；3广州医学院第一附属医院药剂科，广州 510120

他克莫司是一种免疫抑制剂，主要用于肝脏、肾脏等器官移植术后的免疫排斥反应和一些自身免疫性疾病的治疗。由于其个体差异大，有效的治疗药物浓度范围窄，临床常采取药物监测的办法来保证其安全性和有效性。目前国内有针对特定的用药人群进行的群体药代动力学分析，如仇向华[1]对肝移植患者、张关敏[2]对肾移植患者的群体药代动力学分析等，但是从未系统地分析过不同人群的参数差异。本文收集两类用药人群的全量采样数据，运用非线性混合效应模型（NONMEM）进行群体分析，探索人群间的药代动力学参数差异。

1 材料和方法

1.1 数据收集

收集分别来自苏州大学第一附属医院、天津市第一医院的他克莫司全量采样浓度数据。其中苏州大学第一附属医院的受试人群是健康志愿者，采用单剂量口服给药的方式连续测定药后0～72 h药物浓度，使用超高压液质联用（UPLC-MS/MS）分析；天津市第一医院的受试人群是肝移植患者，采用常规免疫抑制剂三联疗法（他克莫司+霉酚酸酯+激素），口服他克莫司达5天以上，测定稳态时谷浓度和给药后0～12 h药物浓度，使用微粒子酶联免疫分析法（MEIA）分析。

记录受试人群的性别、年龄、体重，考察人群差异对他克莫司药代动力学参数的影响。人群间差异记为CENT，其中健康受试者为0、肝脏移植患者为1。分析仪器记为INST，为分类变量，其中UPLCMS/MS为 1、MEIA 为 2。

1.2 数据分析工具

NONMEM软件包（double precision,Version VI,Level 2.2）；G77 Fortran；Origin®8.0；PsN 3.1.0 （Uppsala University,Uppsala,Sweden)；Perl （ActiveState Software Inc.）；PDx3.1 试用版（Icon developmental solutions,Hanover,MD,USA）；操作系统 windows XP。

1.3 模型建立

1.3.1 基础模型 采用二房室血管外给药方式描述他克莫司的药代动力学过程，NONMEM分析时调用PREDPP的advan4、trans4模块，即吸收速度常数（Ka）、中央室清除率（CL）、中央室分布容积（V2）、室间清除率（Q）、外周室分布容积（V3）等参数。由于多次给药达到稳态后，吸收迟滞现象消失，所以仅在单剂量口服给药过程中引入吸收迟滞时间参数（ALAG）。个体间变异采用指数模型[3]，ω为个体间变异的标准差。残差变异采用常系数模型[3]（CCV），根据NONMEM说明书[4-5]，将INST作为残差变异考察，所以设定 ε1、ε2分别是INST等于 1、2时的残差变异（见式1），其中，Y是实际观察浓度，F是模型预测浓度。σ1、σ2即为残差变异的标准差。算法选择一级条件算法（FOCEI）。

1.3.2 协变量模型 NONMEM依据最小扩展二乘法（ELS）与最大似然法（ML）一致，即目标函数最小值OFVmin等于最大似然值-2logLmax进行假设检验，目标函数下降值 （drop of objective function value,DOFV）服从F分布，近似χ2分布。NONMEM可以将个体间变异中的一部分以协变量函数关系的方式来定量解释，通过定显著水平α来决定是否引入协变量。使用PsN[6]的协变量模型程序进行协变量的有序递加和向后剔除。PsN按照协变量的性质选择指示标量模型和乘方模型，逐一考察每个协变量对参数的影响，然后在大于DOFV的协变量中选择目标函数值下降最大的，作为下一步递加的模型。但是由于没有考虑到参数个体间变异和残差变异的优化趋势，所以在每次递加完成后对模型进行筛选，选择目标函数值大于DOFV且个体间变异和残差变异都最大优化的模型。

有序递加 定显著水平α=0.01，通过χ2分布表查知，即当每引入一个协变量（自由度df=1）时，如DOFV＞6.64，那么保留该效应。同时注意每引入一个协变量，个体间变异和残差变异应当减小，或至少不能明显增大。有序递加法（stepwise inclusion）经过筛选后保留的协变量按照DOFV从大到小的顺序依次加入到基础模型中。定显著性水平为α=0.01，df=1，如DOFV＞6.64，则引入模型，依次将筛选出来的协变量加入到模型中去，建立全量回归模型（full regression model,FRM）。

向后剔除 向后剔除法（backward elimination）通过将全量回归模型中的任一协变量剔除进行检验。定显著性水平为α=0.005，自由度df=1，如果DOFV＞7.88，则该协变量对参数有显著性影响，应保留该协变量在模型中，否则将其剔除。所有保留的协变量组成最终模型（final regression model）。

1.3.3 拟合优度评价 为了估算模型的预测精准性，模型拟合优度用群体的权重残差（WR）的平均值 （MWR）和绝对权重残差 （AWR）的平均值（MAWR），以及个体的权重残差 （IWR）的平均值（MIWR）和绝对权重残差（AIWR）的平均值（MAIWR）来评估。公式如下:

其中DV表示观察值，PRED、IPRED分别是模型预测值和Bayesian反馈后的个体预测值。模型如果能很好的预测DV，PRED、IPRED将接近DV，那么WR、MWR、AWR、MAWR就越接近0， 则拟合优度就会越好。做DV-PRED、DV-IPRED散点图可以直观的反映出模型的拟合优度。

1.4 模型验证

为评价最终模型的稳定性和准确度，采用自举法（bootstrap）对模型进行验证和评价。自举法是一种内部验证方法，通过验证最终模型各参数的稳定性，来表示最终模型的稳定性。本文使用PsN 3.1.0[6]进行自举验证，自举法验证的结果以自举500次各参数的95%CI、中位数与最终模型参数的偏差（%）来表示。

2 结 果

2.1 基本资料

我们共收集了65例个体他克莫司药物浓度数据，其中43例为健康受试者，22例为肝脏移植患者术后服用他克莫司的数据。苏州大学第一附属医院的数据采样点是服药前0 h和服药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、10、12、16、24、36、48、72 h，天津市第一医院的数据采样点是达稳态后服药前0 h和服药后 0.33、0.66、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h， 药物浓度均值为 9.87μg·L-1，标准差是 9.89μg·L-1，范围是0.10～70.04μg·mL-1，共计 844 个数据点，年龄范围是19～72周岁，体重范围是 37～87 kg，女性和男性的比例是 5∶60。 见表 1。

表1 他克莫司（FK506）的群体数据集（65例，844个血样）

2.2 群体药代动力学模型（Pop-PK）

2.2.1 基础模型 基础模型为二房室模型，结果见表2。个体间变异最大的参数为V2（119%），最小为Q（62.8%），两种分析仪器之间的残差误差也有差异。由表2可见，UPLC-MS/MS的残差变异为8.47%，MEIA的残差变异为39.10%。这表明UPLCMS/MS的精密度高。基础模型的拟合优度为MWR（0.68%）、MAWR（1.09%）、MIWR（-0.065%）、MAIWR（0.16%）。

表2 群体药代动力学基础模型

2.2.2 最终模型 有序递加法得到全量回归模型，再经过向后剔除法得到最终模型，结果见表3:向后剔除过程中的DOFV为16.93，表明CENT对V2和Q统计学均有显著性意义。

表3 协变量模型建立的结果

最终模型参数表达式见式6:

GEND、AGE、BW等协变量对参数没有显著性影响。人群间差异对参数V2和Q有显著性影响。最终模型表明肝脏移植患者的V2和Q比健康受试者的高出2.34倍和1.69倍。

根据最终模型 Ka、CL、V2、Q、V3的 ω2（见表 4），得个体间变异分别为30.2%、71.8%、131%、42.9%、59.7%。 与基础模型比较，Ka、CL、Q、V3个体间变异分别降低了 38.6%、1.4%、19.9%、23.4%，但 V2的个体间变异略增。 σ12、σ22分别是 0.00714、0.118，所以UPLC-MS/MS、MEIA的残差变异系数分别是8.45%、34.4%。

2.3 模型评价及验证

拟合优度情况为:MWR、MAWR、MIWR 从 0.68、1.09、0.065 下降为 0.52、0.97、0.062，MAIWR 从 0.157略增至0.166。最终模型的DV-PRED、DV-IPRED散点图见图1和图2，决定系数（R2）分别是0.42和0.82。

图1 最终模型拟合的他克莫司群体估算值（PRED）与浓度观察值（DV）的相关趋势图

自举500次，成功371次。各参数自举的95%CI均包含最终模型值，表明模型参数稳定 （见表4），其中 Ka、ALAG、CL、V2、Q、V3分别指的是最终模型参数的标准值，V2-CENT表示CENT对V2的影响参数，ω2（Ka）表示Ka的个体间变异所服从正态分布的方差，其余依次类推。

表4 最终模型拟合的群体参数及自举验证结果（500次自举运行，成功371次）

图2 最终模型拟合的他克莫司个体估算值（IPRED）与浓度观察值（DV）的相关趋势图

3 讨 论

本文收集的数据中女性只占到总数的8%，因此虽然没有发现参数的性别间差异，但是这有待更加均衡的群体分析证实。本文收集的年龄、体重因素，经过群体分析，证实对参数没有影响，这与国内已有文献报道[2,7]一致。

虽然中央室表观清除率（CL）在2种人群间没有发现差异，但是外周室表观清除率（Q）却存在差异。肝脏移植患者的（Q）比健康受试者高出1.69倍。

有文献[8]报道健康受试者的中央室分布容积（V2）显著低于移植患者[9]，这与本研究的结论一致。本文发现肝脏移植患者的V2比健康受试者高出2.34倍。推测的原因是健康受试者的肌体组织正常，红细胞比积高于移植患者，而他克莫司又属于脂溶性药物，因此当血液中红细胞的量增加时，他克莫司主要与红细胞结合，很难再分布到周围组织中去，从而使得V2比患者的要小。

两种分析测试方法在纳入残差变异分析后，结果显示它们之间存在精密度差异，UPLC-MS/MS精密度好。

目前他克莫司主要用于肝脏移植、肾脏移植和造血干细胞移植患者，本研究提示，将这3类患者服用他克莫司的数据进行群体药代动力学分析，将能客观地比较和发现它们之间的群体参数差异。

有文献[3,10,11]报道他克莫司的体内代谢差异与CYP3A5等基因型有关，目前国内已有学者开始研究，其与用药人群间的参数差异的相互作用有待进一步研究。

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