沙棘叶水提物适应原性及安全性评价

花圣卓,王宏昊,滕晓萍,温中平

(高原圣果沙棘制品有限公司,北京 1000037)

很多年来,不仅仅是在亚洲国家,全球各地都在广泛使用中药[4,8]。适应原是指可以增强耐力、心智力和人体非特异性抵抗力的中药配方[4]。研究显示:当身体处于高压力状态时,补充某种营养品或中药制剂可以增强抗应激能力[2,14,19-22]。据推测,在高海拔、恶劣气候环境下生长的植物,体内有能维持它生命的生物分子。将动物置于高寒及缺氧环境下,给动物补充这些植物产品,就能够增强它们的耐受力[6]。

沙棘 (胡颓子科),生长在海拔 2000～5000m的喜马拉雅山脉西北侧,是一种从矮到高 (0.91～4.6m)、有分支,有固氮作用的原产于欧洲及亚洲的有刺落叶灌木[30]。这种植物的所有部分都含有很多生物活性物质。沙棘的化学及植物化学成分随着产地、生长环境及提取方法的不同而有所不同[1,36]。据报道,成熟的沙棘果实内维生素 (A,C,E及K)、类胡萝卜素、黄酮和有机酸的含量都非常高,而且沙棘果实、果浆、果油和籽油提取物具有调节免疫、抗氧化及抗菌作用[10,27],对治疗胃溃疡[32,34]、皮肤病[35]、冠心病[7]、辐射引起的氧化损伤[13]、伤口愈合[15]、血栓症及血小板沉积[5]等各种疾病都有帮助。沙棘的医学效用源自于丰富的抗氧化物质[1,7]。

沙棘叶含有丰富的黄酮、丹宁酸及三萜烯[16],与沙棘果及种子的药理作用相比,沙棘叶在药理方面的研究不多。据报道,沙棘叶在70%乙醇中的提取物具有抗氧化、调节免疫[11]及抗炎[9]作用。在一个研究实验中,在索氏提取器中用70%乙醇提取干燥的沙棘叶,口服单一剂量 (100mg/kg体重)提取物,发现具有抗应激作用[12]。但是,沙棘叶调节压力的剂量依赖性尚待研究。

本文研究了在低温(5℃),低压(428mmHg),抑制 (C-H-R)动物模型下[28],干燥沙棘叶水提物对小鼠的剂量依赖性适应原活性。以及用干燥沙棘叶水提物对动物血浆及血液中生物化学和血液参数的安全性评价来研究提取物的急性或亚急性毒性作用。

1 材料和方法

1.1 试验动物

试验用12～14周龄,重150±10g的雄性Sprague-Dawley大白鼠,在25±1℃及12h亮-暗循环的环境中生长,并用标准的食物及足量的水喂养。试验的实施严格遵循动物道德委员会制定的制度及印度关于试验动物照料及使用规范。

1.2 植物材料

在9月份两个不同时间,采集于位于印度喜马拉雅山脉西侧高海拔地区的沙棘叶。生长在此的沙棘处于自然状况下,可以排除由于区域及气候条件不同造成的植物化学变化。将植物材料的凭证标本保存于干燥标本集内,在印度拉达克列野外实验室内实施植物的民族植物学鉴定。用水彻底清洗新鲜的沙棘叶,再用去离子水清洗。清洗过的新鲜沙棘叶在干净的荫凉处晾干,并用粉碎机碾碎。

1.3 提取准备

用过滤的方法制备沙棘干叶的提取物。在室温 (25±1℃)下,将沙棘干叶粉末浸泡于去离子水内 (1∶5w/v),24h后,将上清液倒出,残留物重新浸泡于新鲜水中,这个过程重复4次直至完全提取。为了避免污染,在提取过程中要保证环境干净无菌。将上清液收集在一起,通过软细棉布过滤,置于有色琥珀瓶内,在 4℃、8000g下离心,然后在-20℃冷冻并用Heto冷冻干燥机 (HITOSICC,Heto-Holten A/S,丹麦)冷冻干燥。冷冻干燥后的沙棘叶水提物储存于-20℃的密封玻璃瓶内待用。冷冻干燥提取的原料产率采用重量分析法,称量沙棘提取物的冷冻干燥粉末及沙棘干叶的质量。由此可得出1g干燥沙棘叶可生产0.137g沙棘水提物冷冻干燥粉末。

1.4 提取物的表征

为了表征沙棘叶水提物,我们测量了它的HPLC指纹图谱和酚总量。

1.4.1 HPLC指纹图谱

用装备有1000UV检测器的AS-3000图谱系统 (Thermo Finnigan,美国)对沙棘叶水提物进行 HPLC分析。将20μ l的1mg/ml的提取物注入HPLC内,然后以1ml/min的速度注入色谱纯甲醇水溶液 (40∶60v/v)。用粒径为5μ m的反相 C-8柱 (250mm×4.7mm)对在310nm处具有紫外吸收的组分进行分离。

1.4.2 酚总量

用福林-乔卡梯奥试剂 (碱性磷酸酶定量试剂)检测沙棘叶水提物中的酚总量。在1mg/ml的提取物储备液中取20μ l,向其中加入 80μ l水和500μ l福林-乔卡梯奥试剂,室温下静置5min,然后加入400μ l 7.5%的碳酸氢钠溶液,混合溶液后静置30min产生颜色,并在765nm处具有紫外吸收。用0.1mg/ml的五倍子酸溶液制备标准吸光度-浓度曲线,沙棘叶水提物内的酚总量就可以用此方法表示出来。

1.5 试验设计

所有的试验都是在过夜禁食的健康小鼠身上进行的,本研究进行了两组试验。第一组试验,低温 (5℃),低压 (428mmHg),抑制 (C-HR)动物模型下,用小鼠评价干燥沙棘叶水提物最大有效适应原活性剂量。另外一组试验,用血浆生物化学参数、血液学参数和重要器官的器官/身体重量比来研究干燥沙棘叶水提物的急性及亚急性毒性。

1.6 剂量依赖性适应原活性研究

沙棘叶水提物的剂量依赖性适应原活性研究共用到66只小鼠,其中12只小鼠用来研究最大有效单剂量的多重剂量影响。沙棘叶冷冻干燥粉末溶于适量水中,得到相对小鼠体重的适量剂量,将小鼠置于C-H-R环境的30min前,用胃管灌入0.5ml提取物到隔夜禁食小鼠体内。设置提取物体积与体重比分别为 3.125、6.25、12.5、25、50、100、150及 200mg/kg体重,每个剂量比对应6只小鼠。用6只鼠作为对照组,将其置于C-H-R环境30min前,服用相同体积的水[28]。

将小鼠置于与海拔4572m相同的环境 (低温 (5℃)、低压 (428mmHg))内,限制鼠活动以便于用胶带将直肠探针植入小鼠直肠内2cm处。用 16道等温记录器 (Columbus Instrument,Columbus,OH)对小鼠直肠温度每分钟检测一次,当小鼠直肠温度达到23℃时,将小鼠移出容器置于正常大气压和32±1℃的环境下使小鼠的体温恢复到37℃。恢复期间,保持室温恒定,在此期间,同样限制小鼠的活动。检测小鼠体温到达 23℃及恢复到 37℃时的耐受性[28]。

5个剂量的沙棘叶水提物,每天服用一个剂量,研究它的最大有效适应原剂量,然后用CH-R动物模型确定服用提取物多剂量是否具有累积的适应原活性。用12只小鼠做多剂量研究,其余每组剂量用6只小鼠。

1.7 毒性研究

1.7.1 急性毒性试验

用48只雄性隔夜禁食的小鼠研究急性毒性试验,并分为4组,每组12只小鼠。每次给每组隔夜禁食的小鼠口服单剂量的1g/kg体重,2g/kg体重,5g/kg体重及10g/kg体重的冷冻干燥提取物,然后立即喂养食物和水,在接下来的24h或24d内在密闭的笼子里观察小鼠的死亡率及严重的毒性反应,如活动减退、毛发直立、厌食、分泌唾液、腹泻、晕厥、肌肉抽筋及痉挛等。如果有小鼠死亡,在研究期间做好记录并计算LD50值。

1.7.2 亚急性毒性试验

用36只小鼠做亚急性毒性试验,并分为3组,每组12只小鼠。第1组:每天按1g/kg体重的量给小鼠服用 0.5ml的提取物,共口服14d;第2组:每天按2g/kg体重的量给小鼠服用0.5ml的提取物,共口服14d;第3组作为对照组,每天给小鼠服用0.5ml的去离子水,共口服14d。试验期间,小鼠自由进食,并且每天记录小鼠的体重。14d试验结束后从三组中取6只小鼠进行生物化学分析,另外6只用来进行血液学和器官与身体比重检测。14d给药结束后,小鼠隔夜禁食并用毛细管从眼窝处获取临床化学血液样品,并将样品收集于含有抗凝剂EDTA的管子内。将小鼠处死后,将重要器官 (肾、肝脏、脾、肾上腺、睾丸、心脏和肺)解剖出来,并清除黏附在上面的结缔组织和污渍,仔细称重,确定器官与身体的比重。

另外24只小鼠做亚急性毒性试验。12只小鼠每天口服最大有效剂量100mg/kg体重的沙棘提取物0.5ml,共口服30d。另外12只小鼠作为对照组每天口服0.5ml去离子水,共口服30d。每天记录小鼠的体重。每组取出6只小鼠进行生物化学分析,另外每组取出6只小鼠进行血液学分析,每组12只小鼠都进行器官与身体的比重分析。30d给药时间结束后,用毛细管从小鼠眼窝处获取血液,并进行生物化学及血液学分析。将肾、肝脏、脾、肾上腺、睾丸、心脏和肺解剖出来,并清除黏附在上面的结缔组织和污渍,仔细地称重,确定器官与身体的比重。

1.8 生物化学分析

用Ascensia Entrust血糖试纸和血糖仪(Bayer Diagnostics India Ltd,Baroda,Gujarat,印度)测试空腹血糖指数,并测定整体的乳酸脱氢酶。用Stat Prole Phox Plus血气分析仪 (Nova Biomedical,Waltham,MA 02454-9141,美国)测定血清转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素、肌氨酸酐、总胆固醇量、甘油三酯、血清蛋白及电解质量。

1.9 血液学研究

用半自动微细胞计数器F-820(TOA Medical Electronics Corporation Ltd,Kobe,日本)对对照组及给药组的小鼠进行血色素及其他血液学参数分析。

1.10 组织学

试验结束后对所有小鼠进行验尸,做组织学器官损伤评定。取出肾、肝脏、脾、肾上腺、睾丸、心脏和肺,用10%的中性福尔马林缓冲溶液固定,然后经过常规处理,包埋于石蜡中,用微切片机切取4μ m的薄片并安在玻璃片上,用苏木精-伊红染色,之后用光镜观察。

1.11 统计学分析

用Graph Pad Prism 2.01对对照组和试验组值进行 t检验,计算统计学差异。用 Graph Pad Prism 2.01对1g/kg体重及2g/kg体重剂量组做亚急性毒性试验的小鼠的生物化学、血液学参数和器官与身体比重进行方差分析。

2 结果

2.1 沙棘叶水提物的表征

提取物的 HPLC指纹图谱图如图1所示,不同批次提取物的保留时间和峰面积的RSD都在2%以内。

图1 沙棘叶水提物在310nm处的指纹图谱

总酚含量 沙棘叶水提物中的总酚含量 (没食子酸当量)为363mg/g(w/w)。

2.2 剂量依赖性适应原活性研究

表1所示的是剂量依赖性适应原活性研究的结果。沙棘叶水提物最低剂量 (3.125mg/kg)在加速压力恢复中有显著效用,小鼠从由C-HR导致的体温 (23℃)恢复成正常体温 (37℃)所需的时间缩短了 22.9%。浓度达到 6.25 mg/kg时,沙棘叶水提物对于抵抗C-H-R导致的体温下降就几乎没有了作用。随着使用的剂量的增加,对C-H-R导致的体温下降的抵抗能力以及从低体温中快速恢复的能力都有所提高。浓度达到100mg/kg时,对C-H-R导致的体温下降的抵抗能力达到了最大值66.4%,同时使恢复能力提高了42%。然而,进一步增加药物使用剂量并不能继续提高对C-H-R导致的体温下降的抵抗能力以及从低体温中快速恢复的能力。所以,沙棘叶水提物的最大有效剂量为100mg/kg体重。

表2是连续5d每天单一剂量给药处理的结果。经过连续5d,每天单次口服100mg/kg剂量沙棘叶水提物,小鼠在C-H-R中体温降低至23℃的时间以及从23℃恢复至37℃的时间与单次量用药几乎没有区别。

表1 单剂量口服后,沙棘叶水提物的剂量依赖性适应原活性

表2 多次单剂量口服后,沙棘叶水提物的剂量依赖性适应原活性

2.3 毒性试验

2.3.1 急性毒性试验

表3给出了急性毒性试验研究的结果。4组小鼠分别每次口服1,2,5和10g/kg沙棘叶水提物。死亡的小鼠中,50%在处理后24h之内死亡或连续处理14d后死亡。

表3 使小鼠口服沙棘叶液体提取物导致的急性中毒情况 (LD50)

2.3.2 亚急性毒性试验

在观察期内,连续14d每日口服1,2g/kg体重的剂量后,所有小鼠仍然都很健康。处理组与对照组小鼠的体重均增长良好 (图2)。表4中列出了小鼠连续14d每日口服1,2g/kg体重的剂量后的生化及血液指标。观察期间,实验小鼠的生化指标没有变化 (每日口服1,2g/kg体重剂量,连续14日,与对照组对比)。然而,研究发现口服2g/kg剂量的小鼠与对照组相比血液指标中红血球数量显著增长,导致红细胞比容增加。表5中列出了口服1,2g/kg体重剂量药物的小鼠的器官重量/体重比。与对照组相比,在1g/kg体重剂量下处理过的小鼠,除肝脏外其余器官 (心脏,肾脏,脾脏,肾上腺,睾丸,肺)的器官重量/体重比无明显变化。而肝脏重量/体重的比有显著增长。与对照组相比,在其余器官 (心脏,肾脏,脾脏,肾上腺,睾丸,肺)重量/体重比上无明显变化的情况下,2 g/kg体重剂量药物处理下的小鼠肾脏重量/体重比有所下降。

表4 小鼠连续14日每日口服1,2g/kg体重沙棘叶水提物的生化指标及血液学参数

表5 小鼠连续14日每日口服1,2g/kg体重沙棘叶水提物的器官重量/体重比

表6 小鼠连续30日每日口服100mg/kg体重沙棘叶水提物的生化指标及血液学参数

表7 小鼠连续30日每日口服100mg/kg体重沙棘叶水提物的器官重量/体重比

图2 小鼠连续14d每日口服1,2g/kg体重沙棘叶水提物后的平均体重变化

图3 小鼠连续 30d每日口服 100mg/kg体重沙棘叶水提物后的平均体重变化

在观察期内,连续30d每日口服100mg/kg体重的剂量后,所有小鼠仍然很健康。处理组与对照组小鼠的体重均增长良好 (图3)。表6中列出了小鼠连续30d每日口服100mg/kg体重的剂量后的生化及血液指标。观察期间,除了血清钠降低外,相对于对照组,实验鼠的生化指标没有变化。但是,在小鼠的血液学参数研究中,我们发现,相对于对照组,实验组的血细胞比容和血小板计数都显著增加。表7中列出了连续30d每日口服100mg/kg体重剂量药物的小鼠的器官重量/体重比。与对照组相比,在100mg/kg体重剂量下处理过的小鼠器官重量/体重比无变化。

在所有的检测中,小鼠肾上腺,心脏,肾脏,肺,脾脏都具有完整的组织学形态,只是在1,2g/kg体重剂量下,小鼠肝脏门脉周围肝细胞表现出轻度空泡 (图4)。

3 讨论

图4 对照组和实验组小鼠口服沙棘叶水提物后肝脏组织的光学显微图 (H&E,×400)

在发展中国家,约有80%的人口在使用中草药。尽管这些传统药物在广泛使用,但对其安全性和有效性的研究却不多。本文定量研究了沙棘叶水提物的 HPLC指纹图谱以及总酚含量。该水提物酚类含量很高 (363mg/g没食子酸当量),可用于观察适应原活性。在剂量依赖性研究中,小鼠在C-H-R动物模型中沙棘叶水提物的最大适应原活性剂量100mg/kg体重。目前只有一个研究沙棘叶抗应激和适应原活性的研究[12]。在这项研究中通过索氏提取用70%乙醇提取沙棘叶,将提取物用于动物模型,发现其最大口服量为100mg/kg体重。将小鼠在低温缺氧环境下暴露半小时,该提取物能供给小鼠大约70%的耐寒能力,使小鼠在C-H-R动物模型中体温降至23℃的时间延长 (112±11.4min vs对照组65min),并增加了33%的快速恢复能力(123±4.6min vs对照组 184±8.4min)[12]。将70%乙醇提取物[12]和本研究的水提物对比,发现它们在C-H-R动物模型中具有相同的御寒能力,但本研究中观察到水提物的恢复能力更强(44%)。适应原活性试验采用5个剂量组,每日口服一次最大有效剂量 (100mg/kg体重),适应原活性跟单剂量研究结果类似,这表明沙棘叶水提物不具有累积适应原活性。

在亚急性期30d的实验中采用100mg/kg体重的剂量,这个最大有效剂量是安全的,因为观察期实验动物体重增加率与对照组相似。实验中实验动物的生化参数,属于正常范围,并没有显示出药物损伤迹象。虽然有一个血清钠水平显著下降,却也在正常范围之内。在血液参数研究中,血细胞比容的增加可能是由于平均红细胞体积 (MCV)微量上升。在本研究中,实验动物的血清乳酸脱氢酶 (LDH)和肌酐含量与对照组相似,表明亚急性毒性试验中沙棘叶水提物并没有对细胞膜的通透性、肌肉代谢、肾功能产生影响。在30d试验中,对比实验组和对照组器官重量/体重比,未发现采用最大剂量口服提取物对重要器官有毒副作用。

在最大剂量10～20倍 (1g和2g/kg体重)剂量组的亚急性毒性研究中,口服14d,跟对照组一样,体重增加,跟毒性有关的生化参数即血清胆红素,肌酐,谷丙转氨酶 (GPT)都没有改变。众所周知,肝脏代谢一系列的外源性和内源性化合物,并且是生物解毒能力的一个良好的指标。谷丙转氨酶的值未改变显示出,持续14d口服1g和2g/kg体重沙棘叶水提物,没有对小鼠肝脏产生毒性。但是1g/kg体重剂量组肝脏重量/体重比的增加和肾脏重量/体重比降低显示出长时间高浓度的口服可能会影响肝脏和肾脏功能。1g/kg体重剂量组的动物显示为肾组织正常,说明没有对肾脏组织产生毒性。但是,在口服14d每天1g和2g/kg体重的剂量组中的动物肝脏病理标本中,发现门脉周围肝细胞有轻度空泡。但肝细胞无退行性改变,也没有任何样本中出现肝坏死或炎症。肝功能的生化试验即谷丙转氨酶检验中,实验组也没有表现出异常。在组织学中观察出轻度空泡不重要。结果表明,该植物提取物所用的剂量并没有对试验考察器官有显著的毒性。

在本研究中,小鼠的血液参数在1g/kg体重剂量组中没有改变。然而,在2g/kg体重剂量组中,小鼠的红细胞数量大幅增加。看起来,低剂量的100mg/kg口服30d的时间和20倍剂量2g/kg药量口服14d都可能对血液参数产生影响,如果一个10倍剂量 (1g/kg)口服持续超过14d时间,也可能会导致血液学参数变化。

物质的急性毒性是指一次性接触较大量的物质对全身的损害能力。急性毒性研究的目的是为了确定半数致死量 (LD50),LD50值被用来表示50%的被暴露个体死于一种有害物质的剂量。在本研究中沙棘叶水提物的LD50值大于10g/kg体重。在5、10g/kg体重剂量组中12只小鼠口服沙棘叶水提物24h后只有一只死亡(8.3%),这说明沙棘叶水提物的毒性非常低。

综上所述,本研究发现小鼠处于C-H-R环境30min后,口服100mg/kg沙棘叶水提物具有明显的适应原活性。其 LD50值大于10g/kg。肝脏和肾脏的器官/体重比及在10和20倍最大有效剂量的高剂量组中组织学的变化,表明长期高剂量使用沙棘叶是需要谨慎。

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