靶向RhoA基因的shRNA对结肠癌细胞黏附和迁移的影响

杨开焰 陈道瑾 李小荣 吴 唯 (中南大学湘雅三医院普外科，湖南 长沙 410013)

RhoA是ras相关的小分子GTP酶超家族Rho亚家族成员，其生物学作用的基础是通过改变细胞骨架肌动蛋白的结构，进而调节细胞形态、极性、增殖、细胞黏附和细胞凋亡等多种生物学行为〔1〕。近年来研究提示RhoA在肿瘤发生和转移中具有重要作用〔2，3〕。目前，有关RhoA与恶性肿瘤侵袭、转移能力的关系研究尚少，本研究应用针对RhoA编码区设计小干扰RNA(siRNA)片段，构建靶向RhoA的shRNA真核表达载体以研究其对结肠癌细胞恶性表型的影响，探讨了RhoA基因表达与结肠癌发生和转移的相关性，从而为结肠癌的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 大肠癌LoVo细胞株来自中南大学湘雅中心实验室。

1.1.2 试剂 RPMI-1640培养液(Gbico)，小牛血清(杭州四季青)，Lipofeetamine 2000(Invitrogen)，Opti-MEN I(Gbico)，RT-PCR kit(QIAGEN)，TRIzol(Invitrogen)，二甲基亚砜 DMSO(Sigma)。鼠抗人GAPDH单克隆抗体，鼠抗人RhoA单克隆抗体(中国台湾 Abnova)，SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)。

1.1.3 仪器 CO2细胞培养箱(SANYO，日本)，倒置显微镜(Olympus，日本)，酶标仪(Bio-TEK，美国)，PCR 仪(Eppendorf，德国)，凝胶成像系统(UVP，美国)。

1.1.4 RhoA siRNA的设计及其重组质粒的构建 设计含有BamHI和PstI双酶切的RhoA siRNA小发夹结构干扰序列(NM-001664CDS的 354～384 bp)如下:正义链:5-CACC GAAGGATCTTCGGAATGATGA TTCAAGAGA TCATCATTCCG AAGATCCTTC TTTTTTG-3;反义链:5-GATCCAAAAAA GAAGGATCTTCGGAATGATGA TCTCTTGAA TCATCATTCCG AAGATCCTTC-3。用T4连接酶将双链寡核苷酸与pGPU6/GFP/Neo线性载体定向连接后转化大肠杆菌DH5α，挑选卡那霉素抗性菌落并扩增培养，然后快速小量制备质粒并行核酸测序鉴定(由上海吉玛制药技术有限公司完成)。RhoA干扰重组质粒命名为PshRNA-RhoA，阴性对照质粒命名为pshRNA-NC。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养人结肠癌LoVo细胞，待细胞长到90%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，10%小牛血清的RPMI-1640培养基吹散细胞，把细胞调整到一定的数目，进行以下的实验研究。

1.2.2 重组体转染LoVo细胞及阳性克隆的筛选及鉴定 3×105个LoVo细胞接种于6孔板，其融合度达90%时分别用PshRNA-RhoA和pshRNA-NC进行转染。48 h后按1∶6稀释传代并换用选择培养基(400 μg/ml维持浓度)筛选14 d，将出现的细胞克隆在培养板中扩增培养并传代建株，命名为PshRNARhoA细胞和pshRNA-NC细胞。

1.2.3 RhoA siRNA对LoVo细胞RhoA表达的影响 实验分3组:LoVo、PshRNA-RhoA细胞组和pshRNA-NC细胞，每组细胞设3个复孔。(1)实时定量PCR:分别收集各组细胞1×106个，提取总RNA逆转录成 cDNA，进行实时定量 PCR反应。RhoA上游引物:5'-agttcccagaggtgtatgtg-3';下游引物:5'-ggacagaaatgcttgacttc-3'，扩增产物238 bp。内参照beta-actin上游引物:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3';下 游 引 物:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'，扩增产物285 bp。反应条件:95℃ 10 s;61℃ 45 s，61℃ 10 s，共40个循环。设 LoVo细胞为内对照，根据2－ΔΔCT公式分别计算 PshRNA-RhoA细胞和pshRNA-NC细胞中RhoA mRNA相对于LoVo细胞的表达量。(2)Western印迹:用细胞裂解液裂解细胞，裂解液煮沸5 min后进行Western印迹分析，一抗分别用鼠抗人GAPDH单克隆抗体(中国台湾Abnova，1∶1 000稀释)和鼠抗人RhoA单克隆抗体(中国台湾 Abnova，1∶1 000稀释)，二抗用 HRP-羊抗鼠IgG，分别用DAB及NBT/BCIP显色。

1.2.4 细胞黏附实验 每孔100 μl纤维连接蛋白(10 μg/ml)包被96孔板，以100 μg/ml多聚赖氨酸和1%牛血清清蛋白包被孔作为最大和最小黏附参照。将LoVo/silence(+)和LoVo/silence(－)细胞分别制备成5×105个/ml细胞悬液，每孔加入100 μl，37℃、5%CO2、饱和湿度孵育 3 h。磷酸盐缓冲液洗涤除去未黏附细胞，多聚甲醛固定，1%亚甲蓝溶液染色20 min;每孔加入 100 μl 1 mol/L HCl，37℃ 40 min，酶标仪测定 600 nm处吸光度值(A值)，细胞黏附率=(实验组A值－牛血清白蛋白孔A值)/(多聚赖氨酸孔A值－牛血清白蛋白孔A值)×100%。

1.2.5 Matrigel侵袭实验 在Transwell上室加入100 μl Matrigel，37℃孵育2 h，分别加入用无血清培养液稀释的LoVo干扰组和LoVo阴性对照组细胞1×105个，下室加入1 ml含FBS的培养基，培养箱内孵育24 h。取出小室，上室用棉签擦净膜上未侵袭的细胞以及Matrigel胶，95%酒精固定15 min，苏木素染色细胞核10 min，取下滤膜，200倍光学显微镜下随机选择5个视野计数细胞，取平均值。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，相同时间两实验组之间采用配对t检验。

2 结果

2.1 RhoA mRNA表达的变化 LoVo细胞在转染PshRNARhoA后，与阴性对照组(5.87% ±0.57%)相比，RhoA mRNA表达量明显下降，抑制率达74.87% ±3.24%。

2.2 Western印迹检测RhoA蛋白表达 Western印迹检测各组细胞RhoA蛋白表达(图1)，pshRNA-RhoA细胞RhoA蛋白的表达量较未转染LoVo细胞减少，经灰度值分析其RhoA的相对表达量是未转染LoVo细胞的36.93%。

2.3 细胞黏附实验 PshRNA-RhoA转染组黏附率为9.24%±2.54%，阴性对照组为42.83% ±1.37%，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 各组RhoA的Western印迹检测结果

2.4 细胞侵袭实验 转染RhoA shRNA重组质粒后，LoVo细胞透膜细胞数(26.5±0.9)个明显低于阴性对照质粒转染组细胞透膜细胞数(53.7±1.4)个，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 细胞侵袭试验结果(HE，×200)

3 讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤最基本的生物特征，是一系列具有内在联系的多个步骤相互作用的结果，其中包括肿瘤细胞的侵袭、迁移、种植等，每个步骤又是由多个因素的共同参与的，因而其具有复杂性。它是目前肿瘤患者死亡的主要原因，因此，对肿瘤转移的研究是肿瘤学研究中最受关注的前沿之一。Rho亚家族是一组分子量为20～30 kD的鸟苷酸结合蛋白，具有GTP酶活性，RhoA、RhoB和RhoC高度同源，约有85%的氨基酸序列相同〔4，5〕。研究发现，大肠癌组织的中RhoA的表达量较相应正常对照组织高，且在RhoA表达阳性的病例中淋巴结转移发生率高〔6～9〕，这在本研究的前期研究中也得到了证实，说明了RhoA基因在结肠癌转移过程中起至关重要的作用。故此，本研究成功设计了靶向RhoA的shRNA表达载体，转染结肠癌LoVo细胞，并进一步观察了其对细胞黏附与侵袭等生物学行为的影响。

RNA干扰(RNAi)是自然界生物体的一种遗传现象，可以诱导目的基因沉默，高效、特异地抑制目的基因。RNAi具有许多传统方法无法比拟的优势，包括特异性、高效性和可传播性，自发现以来，已广泛应用于基因功能、肿瘤和病毒性疾病治疗等的研究〔10〕。LoVo细胞属于高表达RhoA基因的人结直肠癌细胞。通过构建靶向PshRNA-RhoA真核表达载体，经稳定转染人结直肠癌LoVo细胞，通过实时定量RT-PCR和Western blot检测发现干扰组细胞的RhoA mRNA表达量和蛋白量均比正常LoVo细胞下降，其在mRNA水平对RhoA的抑制率达到74.87%，阴性对照组的 siRNA对 RhoA的表达无明显影响(5.87%)，这说明LoVo细胞内RhoA基因已成功的被敲低，我们构建的siRNA不仅作用强大而且具有特异性。在此研究的基础上，体外黏附实验表明细胞在转染PshRNA-RhoA表达载体后，细胞黏附能力下降，说明RhoA与结直肠癌细胞的黏附能力相关。侵袭实验结果显示RhoA表达被抑制后，穿过人工基底膜的细胞数明显少于阴性对照组，表明RhoA蛋白表达量与结直肠癌细胞的侵袭转移密切相关。以上证据表明，RhoA可能与肿瘤的侵袭转移有关，RhoA可能被作为肿瘤基因治疗的新靶点进行研究中具有重要的潜在价值。但shRNA在体内对RhoA基因表达和结直肠癌细胞侵袭转移的影响尚待研究。

1 Chang YW，Bean RR，Jakobi R.Targeting RhoA/Rho kinase and p21-activated kinase signaling to prevent cancer development and progression〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2009;4(2):110-24.

2 Bouzahzah B，Albanese C，Ahmed F，et al.Rho family GTPases regulate mammary epithelium cell growth and metastasis through distinguishable pathways〔J〕.Mol Med，2001;7(12):816-30.

3 Li XR，Ji F，Ouyang J，et al.Overexpression of RhoA is associated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.EJSO，2006;32(10):1130-4.

4 Kimura K，Tsuji T，Takada Y，et al.Accumulation of GTP-bound RhoA during cytokinesis and acritical role of ECT2 in this accumulation〔J〕.J Biol Chem，2000;275(23):17233-6.

5 Hall A.Rho GTPases and the actin cytoskeleton〔J〕.Science，1998;279(5350):509-14.

6 Yoji Takami，Morihiro Higashi，Shinpei Kumagai，et al.The activity of RhoA is correlated with lymph node metastasis in human colorectal cancer〔J〕.J Dig Dis Sci，2008;53(2):467-73.

7 王 颢，陈玉霞，曹冬梅，等.RhoA基因在结直肠癌组织中的表达〔J〕.中华医学杂志，2002;05(82159):348-51.

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9 Yoshioka K，Nakamori S，Itoh K.Overexpression of small GTP-binding protein RhoA promotes invasion of tumor cells〔J〕.Cancer Res，1999;59(8):2004-10.

10 Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells〔J〕.Science，2002;296(5567):550-3.