脾虚证进程中小鼠特异性/非特异性免疫功能变化及中药的干预作用

段永强 成映霞 程 容 梁玉杰 朱立鸣 (甘肃中医学院基础课部，甘肃 兰州 730020)

现代医学已证明衰老进程中主要伴随着机体免疫功能的紊乱或低下，进而导致组织器官功能障碍和代谢废物的堆积。而且中医学所论之“脾”包涵着丰富的免疫学内容，脾虚证与机体免疫器官、非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫以及免疫遗传学等方面异常改变均有显著相关性〔1〕。脾肾两虚是中医学关于衰老的主要病机之一，健脾补肾已成为历代医家延缓衰老和治疗虚劳病症的重要法则。敦煌大宝胶囊(DHDB)是从敦煌石窟遗书中选方化裁，由熟地、黄芪、当归、茯苓、大黄等药味提取加工组成，具有健脾益气、强肾填精、涤痰祛瘀、安和五脏的功效。该制剂经临床应用显示能够有效防治各种虚劳病症，前期研究表明〔2，3〕DHDB具有提高衰老大鼠脑组织细胞膜钠泵活性，拮抗自由基损伤而保护细胞的功能，为进一步探讨该药对脾虚证的干预效应，本研究观察了脾虚证进程中小鼠部分特异性/非特异性免疫功能的变化及DHDB囊的作用效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组 采用SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，鼠龄5 w，体重(20±1)g，由甘肃中医学院医学实验中心提供，SPF级动物合格证号:SCXK(甘)2004-0006-0000201;SPF级实验设施合格证:SYXK(甘)2004-0006-000092。受试动物按体重编号，采用随机数字表法〔4〕分为空白对照组、模型组、DHDB大剂量组、DHDB中剂量组、DHDB小剂量组、补中益气丸组(表示为“阳性对照组Ⅱ”)，每组8只，雌雄各半，分笼饲养。

1.1.2 药品试剂与仪器 DHDB(院内制剂，批号040925);补中益气丸(阳性对照组Ⅱ，兰州佛慈制药厂生产，批号20040912);RPMI 1640培养基(Sigma公司，批号:20050109);聚羟基脂肪酸酯(PHA)(Sigma公司，批号:20050106);刀豆球蛋白 A(Cloncanavalin，ConA，Sigma公司，批号:20050109);脂多糖(Lipopoly Saccharide，LPS，Sigma 公司，批号:20050109);MTT(瑞士Fluka公司，批号:20050224);新生牛血清(上海华美生物工程公司，批号:20050210);淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司，批号:20050208);CO2恒温培养箱(规格型号:MCO-15AC，日本SANYO);酶联免疫检测仪(规格型号:BENCHMARK PULS，美国BIO-RAD);电热恒温培养箱(规格型号:L-303)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及给药 脾虚模型的建立〔5〕:空白对照组每日灌胃等量蒸馏水外，其余小鼠以0.2 ml/10 g生大黄液(每ml含生药1 g)灌胃，每日2次，连续8 d。空白对照组、脾虚模型组给予同体积蒸馏水灌胃;DHDB大、中、小剂量组分别予0.8，0.4和0.16 g·kg－1·d－1DHDB药剂灌胃，等效剂量按人与动物体型系数折算〔6〕(相当于成人剂量的10倍、5倍和2倍);给予阳性对照组Ⅱ0.4 g·kg－1·d－1补中益气丸药剂灌胃(相当于成人剂量的5倍)。各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。连续灌胃14 d，给药容积为0.15 ml/10 g体重。

1.2.2 指标检测及方法

1.2.2.1 DHDB对脾虚证小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响 动物分组给药及模型的建立同“1.2.1”。于末次给药后1 h，每只小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液1 ml，30 min后颈椎脱臼处死，正中剪开腹壁皮肤，取1 ml生理盐水灌洗腹腔，吸出灌洗液0.5 ml，平均分滴于2张载玻片上，用生理盐水漂洗，以除去未贴壁细胞，自然干燥，甲醇溶液固定，加入瑞氏染液染色1 min，滴加pH 6.5的磷酸盐缓冲液(PBS)与染液混匀，静置5 min，自来水冲去染料，干燥后镜下观察计数。计算吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/计数的巨噬细胞×100%;吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞×100%。

1.2.2.2 DHDB对ConA，LPS诱导脾虚小鼠T、B淋巴细胞增殖反应的影响 动物分组给药及模型的建立同“1.2.1”。于末次给药1 h后，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾组织，用Hank's液制成6×107/ml脾细胞悬液。于4×10孔灭菌培养板上分别加入ConA或LPS 100 μl，再按实验动物组别，加入相应脾细胞100 μl，ConA终孔浓度为7.5 μg/ml。LPS终孔浓度为7.8 μg/ml。将培养板置5%CO2培养箱中，37℃饱和湿度下，培养48 h。各孔加入MTT 10 μl后，在上述条件下继续培养4 h。吸去各孔上清液，加入100 μl DMSD，于酶联免疫监测仪在570 nm处测光密度值，作为反映淋巴细胞增殖程度的指标。

1.2.2.3 DHDB对脾虚证小鼠NK细胞活性的影响 动物分组给药及模型的建立同“1.2.1”。于末次给药后1 h，脱臼处死小鼠，无菌条件取脾，用眼科剪刀剪碎，75 μm筛网过滤，制成单个脾细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，去上清，低渗除去红细胞，1 000 r/min离心5 min，去上清，用生理盐水制成单细胞悬液，并稀释至3.0×103个/L。靶细胞取K562体外培养细胞，常规培养24 h，以培养液调整细胞浓度为1.5×102个/L，使效靶细胞比为20∶1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃ 体积分数为5%的CO2条件培养12 h后，加入MTT染色液，再培养4 h后，甩板，加入DMSO摇匀，用酶联免疫检测仪在570 nm测吸光度值。NK细胞活性(%)=〔TO－(S－E)〕/TO×100%，式中TO为靶细胞对照孔吸光度值，S为实验孔吸光度值，E为效应细胞孔吸光度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行处理，组间计量资料比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 DHDB对脾虚证小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数降低(P＜0.05);与模型组比较，DHDB各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数升高(P＜0.05)。见表1。

表1 DHDB对脾虚小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率/吞噬指数，ConA，LPS诱导T、B淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性的影响(n=8，)

表1 DHDB对脾虚小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率/吞噬指数，ConA，LPS诱导T、B淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性的影响(n=8，)

与空白对照组相比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 剂量(g/kg) 吞噬百分率(%) 吞噬指数 OD值(570 nm)ConA LPS NK细胞活性(%)空白对照组 同体积溶媒 44.70±4.97 0.82±0.14 0.80±0.15 0.69±0.10 24 22.41±3.81.53±4.91模型组 同体积溶媒 39.00±4.491) 0.69±0.111) 0.57±0.211) 0.49±0.092) 19.45±4.641)DHDB大剂量组 0.80 42.51±5.79 0.73±0.09 0.79±0.143) 0.63±0.123) 21.18±5.00 DHDB中剂量组 0.40 44.27±6.073) 0.78±0.123) 0.72±0.20 0.51±0.15 23.79±3.853)DHDB小剂量组 0.16 39.67±4.96 0.71±0.07 0.63±0.19 0.46±0.16 22.63±3.01阳性对照组Ⅱ 0.40 43.18±5.653) 0.81±0.083) 0.78±0.183) 0.66±0.134)

2.2 DHDB对ConA，LPS诱导脾虚小鼠T、B淋巴细胞增殖反应的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠ConA诱导的T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B淋巴细胞增殖计数水平降低，对比组间的差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01);与模型组比较，DHDB各组小鼠ConA诱导的T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B淋巴细胞增殖计数水平升高，对比组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 DHDB对脾虚证小鼠NK细胞活性的影响与空白对照组比较，模型组小鼠NK细胞活性降低，对比组间的差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，DHDB各组小鼠NK细胞活性升高，对比组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

3 讨论

研究表明中医学的“脾”包涵着丰富的免疫学内容，而脾虚证与免疫器官、非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫以及免疫遗传学等方面异常改变均有显著相关性〔1〕。脾脏是外周免疫器官，脾脏内含大量由骨髓干细胞发育而来的B细胞和大量T细胞、巨噬细胞，是各种免疫细胞居住、增殖并进行免疫应答及产生免疫效应物质，合成巨噬细胞增强激素的主要场所。“脾虚证”一般有腹腔巨噬细胞吞噬功能及分泌白细胞介素-1(IL-1)等的能力下降。巨噬细胞不仅通过吞噬、杀伤和消化病原微生物等抗原物质发挥非特异性免疫功能，而且通过分泌多种细胞因子，提示抗原启动特异性免疫应答及抗肿瘤等作用参与特异性免疫应答的各阶段。脾虚时单核吞噬细胞功能下降，说明脾虚证机体非特异性免疫功能失调，腹腔巨噬细胞功能下降是脾虚证免疫机能失调的重要机制之一〔7，8〕。

淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。ConA和LPS是T、B淋巴细胞特异性较强的活化刺激剂，在ConA和LPS活化条件下，起反应的主要是T细胞和B细胞。

NK细胞活性代表机体的天然防御功能，其对靶细胞的作用范围远大于杀伤性T细胞，能杀伤某些病毒感染细胞，而对正常未感染细胞无杀伤作用。同时是机体维持免疫监视功能的主要细胞，通过释放淋巴因子如干扰素(IFN-α)、IFN-γ、IL-2等对T、B细胞、骨髓干细胞进行免疫调节，有助于机体自身稳定。研究表明脾虚小鼠NK细胞功能明显降低，自身稳定遭受严重破坏〔9〕。

DHDB以熟地黄和黄芪两味为君而健脾益精、补益气血;辅用当归补血活血为臣而养心脾益肝肾;茯苓补脾益胃，淡渗利水去湿而祛痰，补中有动，以防补气药过于壅滞为之佐药。全方共奏后天脾胃培补先天之肾，先天之肾资助后天脾胃，气血同源互生互化，力求固元培本而健脾益气。本方特色是应用小剂量大黄以通为补，通利肠胃。现代药理学证明熟地黄、黄芪、当归、大黄均对机体免疫功能具有正向调节作用〔10～13〕。本研究表明DHDB可显著提高脾虚证小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，显著提高脾虚证小鼠NK细胞活性(P﹤0.05);在DHDB作用下，脾细胞对ConA和LPS刺激的增殖反应均有增强(P﹤0.05)，提示DHDB既能增强T细胞反应，又能增强B细胞反应，具有提高机体免疫功能的作用。

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