藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞增殖的影响

杜庆聪 裴艳涛 杨国涛 孙雪飞 尹秋伟 吴铭生 (山东大学齐鲁医院胸外科,山东 济南 25002)

藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根,味甘、咸寒、微涩,具有清热解毒、消肿疥、祛风湿的功效。临床上常用于抗肿瘤治疗,尤其对消化道肿瘤疗效较佳。近年研究发现,藤梨根提取物体外对多种肿瘤有抑制作用。不同方法萃取的提取物对肿瘤的抑制效果不同,有研究显示藤梨根乙酸乙酯提取物抗肿瘤效果较佳〔1〕。有关藤梨根对肺癌的作用尚未见报道。本研究以肺腺癌A549细胞系作为研究对象,观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系与细胞培养 肺癌A549细胞系由山东省医学科学院基础所惠赠。培养在含10%小牛血清,青霉素及链霉素各100 U/ml的 RPMI 1640培养液中,37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.1.2 藤梨根乙酸乙酯提取物的制备 将藤梨根(购自济南建联药店)500 g粉碎成20目的粗粉→加8倍水煮2次,每次1 h;过滤浓缩→加入乙酸乙酯溶媒萃取3次(每次300 ml)→回收溶媒,得浓缩物约25 g(含三萜类物质)→蒸馏水热溶→过滤→滤液供实验用(无菌)。

1.1.3 主要仪器和试剂 RPMI 1640培养液(美国Gibco公司),小牛血清(美国 Hyclone公司),四唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶均购自美国 Sigma公司。全自动CO2孵箱(美国杜邦公司 Napoc6100),倒置显微镜(日产Olympus,ZMT-413),450型酶标仪(美国BioRad生产)。鼠抗人Ki-67单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、正常山羊血清购自北京中山生物技术有限公司;标记脱氧嘧啶核苷酸(3H-TdR)(北京原子能研究所);LKB-1217液体闪烁计数器(瑞典产品)。

1.2 方法

1.2.1 药物浓度及配制方法 按照药物血浆峰值浓度(PPC)和预实验结果,以DMSO作为溶剂,将藤梨根乙酸乙酯提取物在临用前用RPMI 1640培养液分别配制成不同的浓度,实验中藤梨根乙酸乙酯提取物的工作终浓度分别为10、20、40、80、160、320 μ g/ml,并使 其 中 DMSO 的 终浓 度 均 不 超 过0.04%。并设空白对照组(0.04%DMSO+细胞)。

1.2.2 倒置显微镜观察藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549细胞形态学变化 取对数生长期的A549细胞,用RPMI 1640培养液制细胞悬液,计数,调整成细胞浓度为1.0×105个/ml的细胞悬液,分别接种于25 ml培养瓶中,每瓶3 ml。37℃常规培养24 h,细胞贴壁后分组:对照组加入含0.04%DMSO的培养液。实验组分别加入新配制的含不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物的培养液,倒置显微镜下动态观察A549细胞用药后24、48、72 h的细胞体积及细胞膜、细胞核等形态变化。

1.2.3 MTT检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞增殖活性的影响 取对数生长期的A549细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度为5.0×104个/ml,接种于96孔培养板中,每孔100 μ l,含细胞5×103,培养24 h待细胞贴壁生长良好时,弃原培养液。实验组分别加入新配制的含不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物的培养液,每个浓度24复孔,6个复孔为一组。对照孔加入含0.04%DMSO的培养液,另设不加细胞孔为空白对照,37℃、5%CO2饱和湿度下分别培养24、48、72、96 h,弃上清,每孔中加入 MTT 溶液 (5 g/L)20 μ l,37℃继续孵育4 h,终止培养。小心吸弃孔内上清液,每孔加入150 μ l DMSO振荡10 min后比色,选择490 nm波长,在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD),以空白对照孔调零,记录结果。按Bliss法计算半数抑制浓度(IC50值)。

1.2.4 集落形成实验观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌克隆原细胞增殖的影响 取对数生长期的A549细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,调整细胞浓度为500个/ml,接种于35 mm培养皿中,每皿2 ml,实验组加入新配制的含不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物的培养液,对照组用含0.04%DMSO的培养液,每组4个培养皿,摇匀后置于5%CO2、37℃培养箱中常规培养7 d,弃去培养液,甲醛固定,Giemsa染色,镜下计数每皿大于50个细胞以上的集落数目。计算集落形成率、集落形成抑制率。集落形成率(%)=(每皿集落数/每皿接种细胞数)×100%。集落形成抑制率(%)=(1-实验组集落数/对照组集落数)×100%。

1.2.53H-掺入法检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞DNA合成的影响 取对数生长期的A549细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度为4.0×104个/ml。接种于96孔培养板内,每孔200 μ l。实验孔加入终浓度分别为20、40、80、160 μ g/ml的含藤梨根乙酸乙酯提取物的培养液,每组设6个平行孔,设对照孔(0.04%DMSO+细胞),分别处理 24、48、72 h。终止培养前 6 h,每孔加入3H-TdR 37 kBq(37 k Bq/ml);培养终止后,经清洗、消化、离心等步骤,用液体闪烁计数器测定每分钟脉冲数(cpm)值;按下式计算不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同时间对A549细胞DNA合成的抑制率:掺入抑制率(%)=(1-实验孔平均cpm值/对照组平均cpm值)×100%。

1.2.6 免疫组织化学(SP)法检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞Ki-67抗原蛋白表达的影响 将经多聚赖氨酸处理的小载玻片预先置于12孔培养板中,取对数生长期的A549细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,调整细胞浓度为1.0×105个/ml,然后接种细胞于培养板。待细胞贴壁生长良好时,弃原培养液,分别加入终浓度为 20 、40 、80 、160 μ g/ml的含藤 梨根乙酸乙酯提取物的培养液3 ml,每浓度设6个复孔,并设对照孔(0.04%DMSO+细胞)。置于培养箱中分别培养24 h、48 h,倒去孔内培养液,取出载玻片,晾干;用4%多聚甲醛固定10 min(4℃)。采用链霉素-生物素(SP)免疫组化技术检测Ki-67抗原表达,全部操作过程严格按照SP试剂盒说明书完成。组织抗原修复采用微波抗原修复法;Ki-67抗原单抗工作浓度均为1∶100。采用已知阳性对照片作阳性对照;以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。Ki-67抗原阳性结果判定为细胞核内出现棕黄色颗粒。将其置于Olympus显微镜下400倍高倍视野下观察,对所测部位进行准确定位后,由摄像系统提取数值化细胞图像输入捷达801系列形态学分析系统,每例选取4个视野进行阳性率测定。以Ki-67抗原阳性表达率为增殖指数(proliferation index,PI)。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行分析,数据资料以±s表示,组间差异比较采用t检验。

2 结 果

2.1 藤梨根乙酸乙酯提取物对人肺癌A549细胞形态的影响倒置显微镜下见用药前细胞排布紧密,贴壁生长,细胞为多边形,核分裂象多见,有细胞重叠,细胞圆亮、饱满,细胞间连接紧密。经过10、20 μ g/ml浓度藤梨根乙酸乙酯提取物处理后细胞数目减少,但形态学改变不明显。当藤梨根乙酸乙酯提取物浓度达到40 μ g/ml时,出现一定程度的形态改变,表现为细胞间连接减少、胞突回缩,细胞体积变小,变圆形;核分裂象减少,核固缩出现,核颜色加深;重叠生长现象减少,细胞数目减少;胞质透亮度下降,颗粒感增强,折光性增强;细胞脱落呈悬浮状,并见细胞碎片。上述变化随藤梨根乙酸乙酯提取物作用时间的延长和浓度的增加而明显。尤其经过浓度为160、320 μ g/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物处理后细胞形态学改变明显,细胞形态极度不规则,细胞崩解形成碎片,见较多死亡细胞。见图1。

图1 倒置显微镜下藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞形态变化的影响(×100)

2.2 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞增殖活性的影响 结果显示一定浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物对人肺癌A549细胞的生长有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。当藤梨根乙酸乙酯提取物浓度为 10 μ g/ml时抑制不明显;浓度在20 μ g/ml时即表现一定的抑制;此后随着藤梨根乙酸乙酯提取物浓度的增加,实验孔内吸光值逐渐降低,浓度在160 μ g/ml时对 A549细胞的生长抑制效果最佳,而浓度在320 μ g/ml时抑制作用无明显增加;并且在同一浓度,随着作用时间的延长,抑制作用逐渐增大,呈现出明显的时间和剂量依赖性。浓度 ＞40 μ g/ml时,藤梨根乙酸乙酯提取物作用各时段吸光值与对照组比较差异均有统计学意义(P ＜0.05);浓度为20 μ g/ml时,作用72 h、96 h后的吸光值与对照组比较才有统计学意义(P＜0.05)。藤梨根乙酸乙酯提取物作用48 h、72 h、96 h的IC50分别为 129.36 μ g/ml、75.42 μ g/ml、58.88 μ g/ml。 见表 1 。

表1 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各组细胞吸光值变化(±s,n=6)

表1 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各组细胞吸光值变化(±s,n=6)

与对照组比较:1)P＜0.05;下表同

组别 剂量(μ g/ml) 24 h 48 h 72 h 96 h对照组 - 0.344 ±0.089 0.521 ±0.068 0.872 ±0.074 1.337 ±0.059实验组 10 0.339 ±0.065 0.509 ±0.080 0.851 ±0.079 1.300 ±0.082 20 0.326 ±0.013 0.465 ±0.019 0.694 ±0.0231)0.997 ±0.0211)40 0.267 ±0.0351)0.368 ±0.0461)0.557 ±0.0511)0.742 ±0.0441)80 0.237 ±0.0431)0.308 ±0.0271)0.417 ±0.0421)0.527 ±0.0361)160 0.192 ±0.0521)0.216 ±0.0481)0.258 ±0.0391)0.273 ±0.0351)320 0.189 ±0.0481)0.209 ±0.0371)0.241 ±0.0311)0.266 ±0.0431)

2.3 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌克隆原细胞增殖的影响集落形成实验结果显示,当藤梨根乙酸乙酯提取物浓度为10 μ g/ml时,对A549细胞的集落形成无明显的抑制作用;当藤梨根乙酸乙酯提取物浓度 ＞20 μ g/ml时对A549细胞集落形成均有抑制作用,并且随着藤梨根乙酸乙酯提取物浓度的增高,抑制作用逐渐明显,集落形成率逐渐降低,集落抑制率逐渐增高,但 160 μ g/ml和320 μ g/ml两种浓度的抑制作用相似,无明显差别;浓度 ＞20 μ g/ml时,各组集落形成数与对照组比较差异显著,有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.4 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞DNA合成的影响 结果显示藤梨根乙酸乙酯提取物对人肺癌A549细胞的DNA合成有明显的抑制作用,且随着藤梨根乙酸乙酯提取物浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用逐渐增强。给药24 h后,80、160 μ g/ml组cpm值下降,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);给药48 h后40 μ g/ml组cpm值与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);而20 μ g/ml组则与对照组比较cpm值始终无显著差异。见表3。

表2 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549细胞的集落形成情况(±s,n=4)

表2 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549细胞的集落形成情况(±s,n=4)

组别 剂量(μ g/ml) 集落形成数 集落形成率(%)集落形成抑制率(%)对照组 - 613.24±23.67 61.32 -实验组 10 597.68±27.18 59.77 2.54 20 482.31±22.62 1) 48.23 21.35 40 346.73±23.45 1) 34.67 43.46 80 246.61±15.89 1) 24.66 56.85 160 141.54±14.24 1) 14.15 76.92 320 140.19±10.32 1) 14.02 77.14

表3 不同浓度藤梨根提取物对肺癌A549细胞3 H-掺入率的影响(±s,n=6)

表3 不同浓度藤梨根提取物对肺癌A549细胞3 H-掺入率的影响(±s,n=6)

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2.5 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞Ki-67抗原表达的影响 Ki-67抗原阳性表现为细胞核显示棕黄色颗粒。藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞的Ki-67抗原表达有明显的抑制作用,随着藤梨根乙酸乙酯提取物浓度的增加和作用时间的延长,细胞 PI逐渐降低,仍以 40、80 、160 μ g/ml 组作用明显,与对照组比较差异显著,有统计学意义(P＜0.05)。见表4,图2。

图2 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549细胞Ki-67抗原表达(SP,×200)

表4 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌细胞Ki-67抗原表达的影响(±s,%,n=6)

表4 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌细胞Ki-67抗原表达的影响(±s,%,n=6)

组别 剂量(μ g/ml) 24 h 48 h对照组 - 78.14±3.42 82.45±4.23实验组 20 72.25±6.45 67.95±5.83 40 65.34±5.78 1) 56.38 ±4.821)80 54.63±6.12 1) 38.66 ±3.451)160 40.54±4.39 1) 26.40 ±5.271)

3 讨 论

目前肺癌的治疗除手术之外,仍以化疗、放疗为主。这些治疗的副作用较大,在杀灭肿瘤细胞的同时常对正常组织产生损伤,如骨髓抑制、肝肾损害等 。中药抗肿瘤已有悠久的历史,中药的低毒、安全、有效已是人们普遍接受的事实,从中药及其他天然药物中寻找新的抗肿瘤药物已成为目前研究的热点。藤梨根(Radix Actinidiae)为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根,近年实验研究也表明复方藤梨根制剂对高转移性人肺腺癌细胞(PG)有较强的杀伤作用,抑制其生长,呈量效关系,抑制率最高达63.67%,可使细胞阻滞于 G0/G1期和细胞内〔Ca2+〕升高,并且上调细胞间隙连接通讯(GJIC)功能;增强多药耐药(MDR)细胞株内阿霉素(ADR)的积聚,减少ADR的外排,部分逆转耐药株K562/ADR和K562/长春新碱(VCR)细胞的MDR;在转录水平下调MDR1 mRNA的表达,从而降低MDR细胞内P-糖蛋白(P-gp)的表达〔2～6〕。因此其抗肿瘤药理研究和临床验证受到广泛关注。本文自制藤梨根乙酸乙酯提取物,观察其对肺癌细胞生长增殖的影响,并探讨其可能的作用机制。

本研究结果显示藤梨根乙酸乙酯提取物对体外培养的A549细胞有明显的生长抑制和杀伤作用,此作用与藤梨根乙酸乙酯提取物浓度和作用时间有关。当浓度≤20 μ g/ml时,作用不明显;当浓度 ≥40 μ g/ml时,抑制作 用增强;当浓度 ≥160 μ g/ml时,效果趋于平缓。随着作用时间的延长,抑制作用逐渐增加,呈现出明显的时间依赖性。证实藤梨根乙酸乙酯提取物具有抗肺癌的作用。

克隆原细胞是指具有持续分裂和自我更新能力的细胞,肿瘤的生长、转移、复发均以克隆原细胞的增殖为基础。集落形成实验反映肿瘤细胞中具有增殖活性的克隆原细胞的增殖能力和潜力,本实验结果显示当藤梨根乙酸乙酯提取物浓度 ＞20 μ g/ml时对肺癌克隆原细胞具有较强的抑制作用,可抑制A549细胞的集落形成率,并存在剂量-效应关系。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以抑制肺癌克隆原细胞的生长,也证实其具有抗肺癌活性。

以上实验显示当剂量 ＜20 μ g/ml时抑制作用不明显,而 ＞160 μ g/ml时抑制作用无明显增强。故进一步实验采用20、40、80、160 μ g/ml等四个浓度进行,并通过3H-Td R 掺入试验检测细胞DNA合成、免疫组化SP法检测Ki-67抗原表达的方法,对藤梨根乙酸乙酯提取物抗肺癌作用机制进行初步探讨。结果显示随着藤梨根乙酸乙酯提取物浓度的增加和作用时间的延长,A549细胞的cpm值及PI逐渐降低。表明藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞的DNA合成有明显的抑制作用,可下调A549细胞Ki-67抗原表达强度,从而降低细胞增殖活性,使细胞增殖受到抑制,此为藤梨根乙酸乙酯提取物抑制肺癌细胞增殖的机制及靶点。而藤梨根乙酸乙酯提取物中的三萜类化合物,可能是其抗肺癌作用的物质基础〔7〕。

总之,应用现代药理、药学的理论及方法深入研究藤梨根有效成分的药用价值和作用机制,对藤梨根的开发应用具有极为重要的经济和社会意义。本研究说明藤梨根乙酸乙酯提取物在体外对肺癌细胞有较强的抑制作用,且呈现出时间与剂量依赖性,抗肺癌作用与抑制肺癌细胞DNA合成、下调Ki-67抗原表达强度、降低癌细胞增殖活性有关,表明藤梨根乙酸乙酯提取物在治疗肺癌方面将具有良好的临床应用和开发前景,但其具体抗肺癌机制有待进一步研究。

1 韦金育,曾振东,吕 琳,等 .中越猕猴桃根提取物抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.广西中医药,2003;26(6):49-50.

2 冯正权,郭 勇,朱宁希,等 .复方三根制剂逆转多药耐药的实验研究〔J〕.中国肿瘤,2003;12(6):370-1.

3 谢长生,周维顺,冯正权,等 .复方三根制剂对MDR细胞株K562/ADR和 K562/VCR逆转作用的研究〔J〕.中国实验方剂学杂志,2003;9(4):26-30.

4 郭 勇,谢长生,冯正权 .复方藤梨根制剂体外对MDR细胞株K562/ADR和K562/VCR细胞积聚和外排阿霉素(ADR)的影响研究〔J〕.中国现代应用药学杂志,2002;19(4):268-72.

5 张海波,姚庆华,郭 勇,等 .复方藤梨根制剂对 PG细胞生长调控的研究〔J〕.浙江中西医结合杂志,2004;14(10):616-7.

6 姚庆华,郭 勇,杨维泓,等,复方藤梨根制剂上调PG细胞间隙连接通讯功能的研究〔J〕.肿瘤研究与临床,2004;16(5):303-5.

7 Whang JI,Moon HI,Zee OP.Phytochemical constituents of actinidia arguta〔J〕.Korean J Pharmacol,2000;31(3):357-63.