不同年龄帕金森病小鼠模型脊髓前角细胞的超微结构变化

陈 敏 劳 明 韦献良 刘承伟 (桂林医学院人体解剖学教研室,广西 桂林 54004)

帕金森病(PD)是一种常见的主要影响老年人的神经系统疾病,其症状主要为躯体随意运动障碍,表现为震颤、肌肉僵硬和运动障碍等躯体运动和肌张力改变。脊髓前角运动细胞作为躯干四肢运动传导通路的下运动神经元,是支配躯体随意运动的重要组成部分。本实验采用MPTP诱导C57BL/6J小鼠制备PD模型,试图说明PD中脊髓前角是否出现病理改变以及出现怎样的改变,并通过不同年龄小鼠的分组探索年龄因素与病理改变的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性C57BL/6J小鼠,SPF级,8周龄16只,18月龄18只,体重20～25 g,由南京大学模式动物研究所提供,饲以我校实验动物中心提供的饲料(成分为大米粉、玉米粉、鱼粉等)。自由摄食、饮水,适应喂养1 w。实验室温度25℃～28℃,通风、自然采光。

1.2 主要试剂 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)。

1.3 动物分组及建立模型 将8周龄和18月龄各随机分成模型组和对照组,即8周龄模型组,8周龄对照组,18月龄模型组,18月龄对照组,各组均为8只。(18月龄模型组原有10只,在建模过程中死亡2只而退出实验。)模型组:每日上午10点腹腔注射MPTP(30 mg/kg体重),每日一次,连续五日;对照组:与模型组同天腹腔注射同体积的生理盐水,连续五日。

1.4 电镜标本制作方法 1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉,快速开胸,经左心室插管至升主动脉,快速灌注生理盐水(p H=7.4),缓慢4%多聚甲醛-2.5%戊二醛灌注。从椎管中取出脊髓,切取颈膨大和腰骶膨大,切成1 mm3小块,按电镜常规做成超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅染色。

2 结 果

2.1 行为学观察 模型组在注射MPTP 5～10 min内显得躁动不安,在笼内来回奔跑、爬高,出现立毛、细小震颤,以下颌呈点头状震颤常见。10 min后开始运动减少,蜷缩成团,笼内几只老鼠多聚卧在一起,此时立毛、竖尾、弓背明显,诱导其活动时步态不稳,以后肢明显,时见拖曳前行。皮毛散乱,失去光泽。目光呆滞,对外界刺激反应降低或根本无反应。3 h后以上急性中毒反应减弱,12 h后基本消失,但运动仍减少。

2.2 脊髓前角超微结构改变 神经元水样变性,线粒体肿胀,嵴间隙变宽,嵴消失,基质浓度降低和部分空泡化;粗面内质网减少、脱颗粒;溶酶体增多,内有吞噬小泡,尤以18月龄模型组明显。凋亡神经元较多,细胞皱缩,核染色质浓缩、边集,胞浆浓缩,电子密度增加。胀亡神经元胞体明显肿胀,核染色质分散,边集,胞膜断裂,胞质出现虫蚀状和空泡化,细胞器减少,线粒体肿胀,粗面内质网扩张(图1)。神经元轴突树突肿胀透亮,微丝、微管失去正常整齐排列,呈断裂、卷曲状,髓鞘褪变,板层断裂、分离。星形胶质细胞增生、肥大,常成群分布,细胞胞体、胞核增大,胞浆丰富,其内细胞器也增多。小胶质细胞增多不明显,胞体增大,突起变短增粗或消失,胞质内溶酶体丰富。广泛出现血脑屏障(BBB)通透性增加的改变。对照组未发现有病理改变。

图1 脊髓前角超微结构改变(×10 000)

3 讨 论

3.1 MPTP的制模机制和PD模型成功的指标 MPTP为强脂溶性化合物,极易透过血脑屏障,但在大脑和小脑中分布较少。MPTP本身没有毒性,可以选择性地浓集于黑质周围,被胶质细胞摄取后,在线粒体内由单氨氧化酶B(MAO-B)使之转变为1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),MPP+的结构和 DA比较类似,被黑质神经元末梢摄取后,通过抑制线粒体的呼吸功能,产生氧自由基和Ca2+内流的改变等作用使黑质神经元细胞坏死、凋亡,产生类似于PD的症状和病理改变〔1〕。因此,MPTP是制作PD模型的 理想药 物〔2〕。 C57BL/6J小鼠对 MPTP 较 为敏 感〔3〕,MPTP诱导的C57BL/6J小鼠PD模型10多年来已在各国实验室广泛采用。

在本实验中,我们以中等剂量〔4〕(30 mg/kg体重,连续5 d)的MPTP腹腔注射诱导的C57BL/6J小鼠PD模型,小鼠打药后出现急性中毒反应,表现出典型的PD行为学改变,电镜观察到包括黑质致密区在内的中脑腹侧多巴胺能神经元的严重缺失(资料待发表),本实验结果显示在脊髓前角出现神经元的缺失和星形胶质细胞的增生等与黑质的改变类似,因此,我们认为所建模型是成功的。

3.2 年龄因素与病理改变的相关性 年龄老化导致多巴胺递质逐年减少,但老年人患病者仅为少数,且好发年龄通常在51～60岁之间,按年龄推断,如果老化是惟一病因的话,此时多巴胺水平尚未达到足够低的程度,说明生理性多巴胺能神经元退变不足以引起本病,只有黑质多巴胺神经元减少50%以上,纹状体多巴胺递质减少80%以上,才会出现PD的临床运动症状,而正常神经系统老化并不会达到这一水平。此外,正常老化发生的黑质多巴胺能神经元脱失的形式与PD不同,前者的神经元脱失位于黑质背层,而后者的神经元脱失绝大部分位于腹外侧层,绝少部分位于背层。因此,年龄老化只是PD的促发因素之一。

实验选取了8周龄和18月龄的两个年龄段小鼠作为实验对象进行分组研究,考察年龄因素与病理改变的相关性。实验过程中,在相同的剂量和条件下,均是18月龄组小鼠出现死亡情况,我们考虑是由于老龄小鼠对药物毒性作用的耐受力较弱,且本实验数据结果分析中老龄模型组的病理改变较成年模型组更为显著,提示年龄老化确实是PD发生不可忽视的原因。随着年龄增加,谷胱甘肽过氧化酶及过氧化氢酶减低,单胺氧化酶增加,铁、铜、钙聚集,黑色素聚集,且黑质、纹状体多巴胺神经元发生退行性变,色素颗粒及神经细胞脱失,均为正常神经系统老化的改变,但同时又是PD病理变化的基础。因此,我们认为,用老龄小鼠制备PD模型更能模拟PD真实的发病条件,是更为适当的选择。

3.3 PD中的脊髓前角改变 PD是临床一大顽症,虽经国内外学者多年的潜心研究,但是其发病机制尚不完全清楚。目前一般研究认为PD的发生与纹状体-黑质-纹状体锥体外路系环路功能障碍有关。在此环路中,中脑黑质对骨骼肌运动的调节起着重要作用。黑质的致密部多巴胺能神经元合成释放DA,并投射到新纹状体,通过黑质纹体纤维储存于新纹状体内,有抑制苍白球活动作用。所以当黑质受损时,使新纹状体的多巴胺含量减少80% ～99%,因而来自纹状体-黑质-苍白球对脊髓前角运动神经元的抑制大大减弱甚或消失,脊髓前角运动神经元功能被释放,则出现肌张力增强,运动减少,同时伴有肌震颤〔5〕的发生。按照此学说,脊髓前角细胞应该没有受到损伤,只是功能发生了改变。但是,在本实验中,我们通过透射电镜观察到在PD中脊髓前角细胞发生了器质性病理改变,包括神经元大量的变性、胀亡及凋亡和神经胶质细胞的增生。脊髓前角神经元大部分为躯体运动神经元,支配躯干和四肢的运动。因此,我们认为,脊髓前角神经元数量的急剧下降以及变性神经元的广泛出现是导致PD模型组动物运动减少的原因之一。

PD的特征性病理变化之一为胶质细胞增生,主要包括星形胶质细胞和小胶质细胞。在本实验中观察到脊髓前角星形胶质细胞广泛肥大增生,我们认为星形胶质细胞增多的原因如下:MPTP必须被星形胶质细胞摄取,才能转化成为MPP+,因此,神经元的损伤根源之一于星形胶质细胞的物质代谢。迅速增殖的星形胶质细胞在损伤部位形成一个相对较封闭的环境,阻止炎症向其他区域扩散〔6〕。星形胶质细胞在 PD病变的整个过程中,其数量、形态以及功能都发生了变化,产生了种类多、数量大的各种细胞因子及神经营养因子,这些因子相互促进,相互制约,既参与了PD的发病,更在神经的再生修复过程中发挥着不可忽视的作用。我们认为,星形胶质细胞对神经元的保护和修复功能远远大于它对神经元的损伤,有着广泛的研究和治疗前景。

本实验发现小胶质细胞的增生不明显,但是可见到激活的小胶质细胞。对于这个结果,我们考虑是由于小胶质细胞活化先于神经元变性。有研究表明:小胶质细胞反应于注射MPTP 12 h后开始,12～48 h高峰,7 d后无明显变化,而酪氨酸羟化酶免疫组化阳性细胞于72 h后开始减少。本实验中在MPTP注射5 d取材,此时小胶质细胞增生的高峰期已过,因此小胶质细胞的增生不明显。但是,我们观察到的小胶质细胞体积大,无突起,有吞噬物,提示此时的小胶质细胞为活化型。活化的小胶质细胞通过释放大量的炎性因子产生炎性反应对神经元产生毒性作用。也有学者认为活化的小胶质细胞可以产生抗炎细胞因子〔7〕。但是许多研究证实,活化的小胶质细胞的致病作用远远大于它的神经保护作用,如 He等〔8〕于应用盐酸米诺环素(美满霉素)可以抑制PD模型黑质内的小胶质细胞的增生,同时可以保护多巴胺能神经元。

关于脊髓前角产生病理改变的原因,我们考虑有如下可能性:第一,黑质受损累及脊髓。①MPTP在黑质转化成MPP+后,通过纹状体-黑质-纹状体锥体外路系环路的物质运输和交换到达脊髓前角,再被脊髓前角神经元的树突主动摄取,通过抑制线粒体的呼吸链导致神经元损害。②黑质病变产生了各种炎性因子、氧自由基等有害物质通过体内循环的各种途径到达脊髓,引起脊髓前角细胞产生炎性反应导致病变。第二,脊髓直接受到损害。MPTP直接被脊髓前角的星形胶质细胞摄取,产生MPP+,被脊髓前角神经元摄取而损伤。我们认为脊髓前角细胞的病理性变化是PD运动障碍的原因和结构基础之一,PD的病变部位更加广泛,并不局限于黑质和纹状体,而是涉及中枢神经系统其他部分,甚至是全身性疾病。

但是,在实验中我们是以MPTP制作PD模型来显示PD的发病过程和症状,而PD患者的发病并不是由于MPTP的作用,所以,也有可能是MPTP对脊髓有损害,而PD患者就不一定存在该损害。因此,对于脊髓前角的病变还有待进一步研究。

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5 朱长庚.化学神经解剖学〔M〕.武汉:同济医科大学出版社,1987:86-93,112-5.

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7 Lee YB,Nagai A,Kim SU.Cytokines,chemokines,and cytokine receptors in human microglia〔J〕.J Neurosci Res,2002;69(1):94-103.

8 He Y,Appel S,Le W.Minocycline inhibits microglial activation and protects nigral cells after 6-hydroxydopamine injection into mouse striatum〔J〕.Brain Res,2001;909(12):187-93.