芍药苷减轻小鼠LPS性急性肺损伤的作用机制研究*

张 斌， 李红梅， 王 媛， 王发强， 王一阳， 吕秀秀， 戚仁斌， 陆大祥， 王华东

(1中山大学附属第五医院胸心外科，广东 珠海 519000;2暨南大学医学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理学重点实验室，广东 广州 510632)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是以中性粒细胞浸润的炎症反应、微血管和肺泡上皮弥漫性损伤、肺水肿及肺间质纤维化等为病理特征的一种临床综合征，严重者即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，可由创伤、肺炎和脓毒症等引起［1，2］。文献报道，高达40%的脓毒症患者伴发ALI/ARDS［3］;脓毒症的重要致病因子，革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可通过多种途径导致 ALI［4，5］;ALI/ARDS 是脓毒症患者死亡的重要原因［6］。因此，寻找有效策略防治脓毒症相关性ALI/ARDS和LPS诱导ALI对脓毒症的治疗具有重要临床意义，一直是人们高度关注的研究领域［7］。

我们前期研究发现，芍药苷(paeoniflorin，Pae)能显著降低内毒素血症小鼠的死亡率，抑制LPS诱导的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)的产生，促进抗炎因子IL-10的表达，减轻腹腔注射LPS 诱导 ALI［8］。随后，Zhou 等［9］的研究也进一步证实Pae能减轻气道滴注LPS引起的ALI。然而，Pae减轻LPS诱导ALI的机制尚缺乏充分研究。研究表明，炎症细胞因子、中性粒细胞与胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)在腹腔或静脉注射LPS诱导的 ALI的发病机制中发挥重要作用［2，10-13］，因此，本研究旨在观察 Pae 对 LPS 攻击小鼠肺中性粒细胞聚集及cPLA2活化的影响，以进一步阐明Pae减轻内毒素性肺损伤的作用机制。

材料和方法

1 动物

清洁级雄性 BALB/c小鼠，6-8周龄，体重21-23 g，购自广东省实验动物中心，合格证号为SCXK(粤)2008-0002。小鼠分笼饲养，自由饮水进食，实验前置实验环境中适应3-4 d，实验环境温度控制在(24±2)℃，相对湿度为60%-80%。小鼠处理符合暨南大学实验动物管理的相关规定。

2 主要试剂与仪器

2.1 主要试剂 LPS(大肠杆菌O55∶B5)购自Sigma，芍药苷(Pae)购自广东省药品检验所。小鼠抗小鼠髓过氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)单克隆抗体购自 R＆D;兔抗小鼠甘油醛 -3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自 Cell Signaling Technology;兔抗小鼠cPLA2、磷酸化的胞浆型磷脂酶A2(phospho-cPLA2，Ser505)抗体购自Cell Signaling Technology;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗小鼠Ⅱ抗购自北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司。BCA-100蛋白定量试剂盒购自上海申能博彩生物公司。

2.2 主要仪器 Western blotting装置(Bio-Rad);BX40型光学显微镜(Olympus)。

3 方法

3.1 实验分组及模型建立 将雄性BALB/c小鼠随机分为4组:对照组(control)、(LPS)组、Pae+LPS组(Pae+LPS)、Pae组(Pae)。分别以双蒸水(0.1 mL/10 g)、Pae(20 mg/kg，0.1 mL/10g)灌胃，1 次/d，连续3 d，第3 d灌胃后1 h，腹腔注射生理盐水［normal saline(NS)，0.2 mL/10 g］或 LPS(20 mg/kg，0.2 mL/10 g)。

3.2 肺组织病理学检查 腹腔注射NS或LPS后12 h处死小鼠，开胸取左肺，固定于4%甲醛溶液中，随后进行石蜡切片及常规HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理学改变。由同一个实验者在光镜下观察以下组织学特征，根据Su等［14］提出的评估肺病理损伤方法，将肺中性粒细胞浸润和肺出血分为4级，0:正常;1:25%的视野有损伤;2:50%的视野有损伤;3:75%的视野有损伤;4:弥漫性肺损伤。肺中性粒细胞浸润(neutrophil infiltration)和肺出血(hemorrhage)评分最终结果以平均秩(mean rank)表示。

3.3 蛋白免疫印迹法检测肺组织 MPO、cPLA2及phospho-cPLA2的含量 腹腔注射NS或LPS后12 h处死小鼠，开胸取右肺，冰生理盐水(4℃)冲洗，滤纸吸干，加入0.5 mL的RIPA裂解液(含终浓度为1 mmoL/L的PMSF)，充分匀浆，冰面静置30 min，13200 r/min离心30 min(4℃)。BCA-100蛋白定量试剂盒检测肺组织匀浆液中总蛋白含量。按每个泳道孔加入70 μg蛋白样品进行10%丙烯酰胺 SDS-PAGE凝胶电泳。Bio-Rad半干转印仪15 V恒压转印 18 min至硝酸纤维素膜上。TBST配制的5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜。分别加入1∶1000稀释的小鼠抗小鼠MPO、兔抗小鼠cPLA2和phospho-cPLA2Ⅰ抗液，以GAPDH为内参照，4℃过夜孵育。加1∶4000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔Ⅱ抗孵育液，室温孵育1 h。化学发光法检测抗原抗体复合物含量，BI2000软件分析蛋白条带的积分吸光度值，以MPO/GAPDH和phosphocPLA2/cPLA2积分吸光度比值分析结果。

4 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件分析。计量资料采用均数±标准误(E)表示，多组间比较用单因素方差分析ANOVA(SNK法)。等级资料用平均秩表示，两独立样本比较采用Wilcoxon秩和检验。

结 果

1 肺组织病理学改变

光学显微镜下可见，LPS注射12 h，肺泡间隔明显增厚，大量炎症细胞浸润，明显肺出血及肺水肿;Pae+LPS组肺组织炎症细胞浸润，出血明显轻于LPS组;空白对照组及Pae组肺组织结构完整，无出血、水肿，见图1。

Figure 1.Representative photomicrograph of lung from mice 12 h after LPS or normal saline injection in control(A)，LPS(B)，Pae+LPS(C)，Pae(D)groups.The lung histological sections were stained with hematoxylin-eosin.Pae:paeoniflorin.Scale bars represent 50 μm.图1 腹腔注射LPS或生理盐水后12 h各组小鼠肺组织形态学改变

2 肺组织形态学评分

如图2所示，LPS注射12 h后，LPS组中性粒细胞浸润和出血显著增多;Pae+LPS组肺组织中性粒细胞浸润(4.75 vs 10.60)和出血(4.63 vs 10.80)评分的平均秩显著低于LPS组(P＜0.01)。

Figure 2.Histological scores(neutrophil infiltration and hemorrhage)of lung from mice 12 h after LPS or normal saline administration in LPS and Pae+ LPS groups.Pae:paeoniflorin.Values are presented as mean rank.n=8.▲▲P＜ 0.01 vs LPS group.图2 腹腔注射LPS或生理盐水后12 h小鼠肺组织形态学评分

3 Pae对LPS处理小鼠肺组织MPO含量的影响

如图3所示，小鼠腹腔注射LPS 12 h后，与对照组相比，LPS组肺组织 MPO含量明显增加(P＜0.05);事先给予Pae灌胃能显著抑制LPS引起的小鼠肺组织MPO含量的增加(P＜0.05)。Pae组与正常对照组相比，肺组织MPO水平未见显著差异。

Figure 3.Effect of Pae on MPO content in lung tissues 12 h after LPS administration.E.n=6.*P＜0.05 vs control group;▲P＜ 0.05 vs LPS group.图3 Pae对LPS处理小鼠肺组织MPO含量的影响

4 Pae对LPS处理小鼠肺组织cPLA2磷酸化水平的影响

如图4所示，腹腔注射LPS 12h后，肺组织中磷酸化cPLA2水平明显高于正常对照组(P＜0.05)，事先给予Pae能显著抑制LPS引起的cPLA2的磷酸化(P＜0.05)。Pae组与正常对照组相比，肺组织磷酸化cPLA水平未见明显差异。

Figure 4.Effect of Pae on phospho-cPLA2protein expression in lung tissues.E.n=6.*P＜0.05 vs control group;▲P＜ 0.05 vs LPS group.图4 Pae对LPS处理小鼠肺组织磷酸化cPLA2含量的影响

讨 论

本研究中，我们首先观察小鼠腹腔注射 LPS 12 h后肺组织形态学改变。光学显微镜下可见，LPS组肺组织损伤明显，肺泡间隔明显增厚，大量炎症细胞浸润，肺出血及肺水肿明显;预先给予芍药苷灌胃，可明显减轻LPS诱导的肺组织损伤，减少肺组织炎症细胞浸润、肺出血及肺水肿等。这些结果表明，Pae可显著减轻腹腔注射内毒素引起的ALI，进一步证实了我们先前报道的结果［8］。

Uchiba等［10］发现，静脉注射LPS 30 min后大鼠肺组织中即出现大量中性粒细胞聚集，随后肺血管通透性明显增加;用氨甲喋呤减少大鼠血中白细胞后，LPS诱导的肺血管损伤则明显减轻。Abraham等［11］进一步研究发现，用环磷酰胺或中性粒细胞抗体减少中性粒细胞后，腹腔注射LPS诱导的小鼠肺水肿则明显减轻，LPS诱导的肺组织转录因子核因子-kappa B活化被明显抑制，IL-1β等炎症细胞因子的表达明显减少。这些结果说明，中性粒细胞在腹腔或静脉注射LPS诱导的肺部炎症反应和急性肺损伤的启动环节中发挥重要作用。本研究发现，Pae预处理能明显减少LPS攻击小鼠肺组织中性粒细胞浸润，表明抑制中性粒细胞向肺组织浸润可能是Pae防止内毒素性ALI的机制之一。

为了进一步验证Pae防止内毒素性ALI的上述机制，我们采用Western blotting检测肺组织中MPO的含量，结果发现腹腔注射LPS明显增加了小鼠肺组织MPO水平，Pae预处理可显著降低LPS处理小鼠肺组织中MPO含量。MPO是一种高表达于中性粒细胞的蛋白酶，是中性粒细胞浸润的主要标记物［15］。上述结果进一步证实抑制中性粒细胞向肺组织浸润是Pae防止内毒素性ALI的重要机制。新近有研究表明，MPO缺乏可减轻 LPS诱导的肺损伤［15］，我们研究发现，Pae能减少LPS处理小鼠肺组织中MPO的含量，提示减少肺组织中MPO的水平也可能参与了Pae防止内毒素性ALI的机制。然而，Pae通过何种机制减少LPS诱导的中性粒细胞向肺组织浸润，尚需进一步研究。Calkins等［16］研究发现，TNF受体p55基因敲除小鼠受到腹腔注射LPS攻击后，肺组织趋化因子的产生和中心粒细胞浸润程度明显低于野生型小鼠，说明TNF介导了腹腔注射LPS诱导的肺组织中性粒细胞浸润。我们先前的研究发现Pae可抑制 LPS诱导 TNF的产生［8］。因此，Pae可能通过抑制TNF的表达减少LPS诱导的中性粒细胞向肺组织浸润。

另一方面，Nagase 等［13］研究证实，cPLA2是内毒素血症诱导ALI的关键介质，抑制cPLA2的活化能显著抑制LPS诱导的ALI。cPLA2催化中心连接区域的Ser505位点被磷酸化后激活，形成具有酶催化活性的cPLA2(phospho-cPLA2)，phospho-cPLA2通过催化细胞膜磷脂产生花生四烯酸 (araehidonieaeid，AA)和血小板活化因子，参与LPS诱导的ALI［13，17，18］。为了进一步阐明 Pae 减轻 LPS 性 ALI的作用机制，我们采用蛋白免疫印迹法检测肺组织中phospho-cPLA2(Ser505)的表达。结果表明，内毒素血症小鼠肺组织中磷酸化cPLA2水平显著增高，芍药苷可显著降低内毒素血症小鼠肺组织cPLA2的磷酸化。这些结果提示，Pae预防内毒素性肺损伤的机制与其抑制cPLA2的磷酸化有关。

综上所述，Pae能明显减轻腹腔注射LPS诱导的ALI，其作用机制与减少肺组织中性粒细胞浸润、MPO含量及抑制cPLA2活化有关。本研究发现Pae能抑制LPS攻击小鼠肺组织中cPLA2的活化，从一个新的角度阐明了Pae防治LPS性急性肺损伤的作用机制，为Pae用于脓毒症性肺损伤的治疗提供有力的实验依据。

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