CCL3L1基因拷贝数目变异与慢性乙肝的易感性相关*

郑灵燕， 裴元元， 李淼新， 周 翔， 黄玮俊， 丁红珂， 王一鸣△

(1中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广东 广州 510080;2香港大学精神病学系，脑与认知科学国家重点实验室，中国 香港)

乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染而引起的以肝脏损害为主要表现的关系到全球公共卫生的重大疾病，尤其在发展中国家。我国是乙肝的高发国家，据卫生部2006年的统计，我国人群中乙肝表面抗原 (hepatitis B surface antigen，HBsAg)的阳性率为 7.18%(http://www.chinacdc.cn/n272442/n272530/n3479265/n3479303/37089.html)。

拷贝数目变异(copy number variations，CNVs)是近年来新揭示的一类基因组变异，含相应基因组节段的缺失、重复及复杂重排等［1］，是疾病发生的重要遗传学基础。拷贝数目变异的基因组节段占整个人类基因组的12%［2］，覆盖人类基因组中13%的基因及5%以上的编码序列［3］。现已证明拷贝数目的变异与精神分裂症［4］、自闭症［5］等疾病相关。

CCL3L1(chemokine CC motif ligand 3－like 1;RefSeq NM_02l006)基因编码CCL3L1蛋白(UniProt ID∶P16619)。CCL3L1是一种强效的化学趋化性细胞因子，属于趋化性因子β亚型(CC型)［6］。趋化性细胞因子是一类低分子量的多肽，其受体为7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族成员。趋化性细胞因子作为细胞间信号传递分子，可以调节免疫应答、参与免疫细胞分化发育、介导炎症反应等。科学家对57个不同人种的检测表明，在各人种中CCL3L1基因均存在拷贝数目多态性，如其在白人中的中位数为2，而在非洲裔黑人中为6，这组学者检测了45例中国汉族人群CCL3L1基因的拷贝数目，并报道我国汉族人群的中位数为4［7］。研究的新进展表明，CCL3L1拷贝数目变异与艾滋病的易感性及疾病进展、严重程度相关［7］，也与丙型病毒性肝炎的易感性相关［8］，2010年一项关于CCL3L1拷贝数目变异与静脉吸毒者人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染相关关系的研究显示HBV是一个协同因素，HBV血清学阳性能提高HIV的感染率［9］。但还没有CCL3L1拷贝数目变异与乙肝相关关系的报道。因此，我们采用大样本量研究了我国汉族人群中CCL3L1拷贝数的分布情况，及其与慢性乙肝间的易感性关系，并初步探讨可能的机制。

材料和方法

1 研究对象

收集2006年12月－2010年3月间在中山大学第三附属医院感染科住院的慢性乙肝病人。慢性乙肝的诊断按中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会标准［10］。入选者均排除了其它肝炎病毒的感染、人类免疫缺陷病毒的感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝及妊娠期、正在接受抗结核药物治疗的病人、静脉吸毒者、不同意加入本项研究者等。最终有1477例乙肝患者入选本项研究。

健康对照来自自愿参与本研究的知情同意者。入选条件为临床和实验室检查证实为健康;所有健康对照均进行了乙肝两对半(HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb)及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)的检测，且证实为非乙肝患者，也非乙肝病毒携带者。

2 方法

2.1 CCL3L1基因拷贝数目检测 使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(ABI)，用Taqman探针进行实时定量PCR(qPCR)，检测CCL3L1基因的拷贝数目。在绝对定量的模式下，选取A431细胞的DNA作为标准品(已知A431细胞双倍体基因组含2个拷贝的CCL3L1基因)，以2倍浓度差做梯度稀释，每个浓度均重复3次，同时扩增目的基因CCL3L1及内参照基因β－globin构建标准曲线。CCL3L1基因与管家基因β－globin的引物与探针序列如文献报道［7］。每一板均做标准品的标准曲线，同时检测待测样本的目的基因CCL3L1及内参照基因β－globin，每个样品均重复3次。利用ABISDS 1.4序列分析软件，读取每个样品的初始模板量，同时计算每板结果的板间差异系数(板间差异系数为每一板中CCL3L1基因标准曲线与 β－globin基因标准曲线的斜率比)。CCL3L1的拷贝数目等于CCL3L1的起始模板量与β－globin的起始模板量的比值，乘以板间差异系数，再乘以2。此检测由2个独立的研究者用双盲法进行。

2.2 CCL3L1拷贝数目与其mRNA、编码蛋白CL3L1生成量及其趋化效力关系的研究 选取拷贝数为1(n=6)，拷贝数为2(n=6)，拷贝数为3(n=6)，拷贝数为4(n=6)，拷贝数为5(n=6)，拷贝数为6(n=6)，拷贝数为7(n=5)，拷贝数为8(n=5)的标本(n表示标本例数)。

运用qPCR检测mRNA的表达量。首先，用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总 RNA;然后用 Super-ScriptTMII RNase H逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录反应;最后，采用试剂盒2×Power SYBR Green Master Mix®(ABI)，在相对定量模式下，选取一个cDNA样本2倍浓度差做梯度稀释，扩增目的基因CCL3L1及管家基因GAPDH构建标准曲线，使用ΔΔCt法计算每个待测样本的相对cDNA量。CCL3L1 cDNA，上游引物为 5'－TCTCTGCAACCAGGTCCTCTC －3'，下游引物为 5'－GGAGGTGTAGCTGAAGCAGCA－3'。GAPDH cDNA，上游引物为 5'－CAGAACATCATCCCTGCC －3'，下游引物为 5'－ GGTGCTAAGCAGTTGGTG －3'。

用Duoset ELISA development system(R＆D Systems)对蛋白产物进行定量分析。先将标准品进行倍比稀释，用Fluorstar fluorescent plate reader(Tecan)绘制标准曲线;然后通过标准曲线检测待测样本的A450，计算样本的蛋白浓度。每个样本检测2次。

用Transwell法检测不同拷贝数目的趋化效力［6］。构建Transwell小室，每个外室孔内加入10% 含胎牛血清的DMEM培养基，PBS缓冲液可替代DMEM培养基作为阴性对照。用Calcein将活U973细胞染色，每个内室小孔加入已染色的U973细胞约1×105。37℃、5%CO2孵育箱中孵育105 min后，用Fluorstar fluorescent plate reader(Tecan)检测每个小孔的A490值，每个孔的A值减去阴性对照孔的A值后，计算相对趋化效力。

假定拷贝数目为1样品的相对表达量及趋化效力为1，以此计算其它各组样品的相对表达量以及趋化效力。

3 统计学处理

用中位数进行统计描述，用Pearson's卡方检验检测CCL3L1基因拷贝数目变异与乙肝易感性的相关关系。运用Logistic回归校正性别与年龄后，进一步分析CCL3L1与乙肝易感性的相关关系。

结 果

1 研究对象

表1显示了病人组与正常对照组的基本临床资料。收集1477例病人，男女比例为1093∶384。正常对照1023例，男女比例为508∶515。所有研究对象均为中国汉族人。

表1 病人与正常对照的基本临床资料Table 1.Clinical data of patients and controls

2 我国汉族健康人及慢性乙肝患者CCL3L1拷贝数目的分布情况

对50例随机人群进行CCL3L1拷贝数目的检测，结果显示CCL3L1拷贝数目在我国汉族人群中呈常态分布，中位数为4，与美国学者报道的从45例中得到的数字相同。进一步检测1477例慢性乙肝病人及1023例健康对照的CCL3L1拷贝数目，结果病人和健康对照的中位数均为3，但在较为极端，即拷贝数目很低及很高的个体中，两组的分布显然有差异，见图1。

3 CCL3L1拷贝数目与其mRNA、编码蛋白CL3L1生成量及趋化效力相关关系

图2显示了CCL3L1拷贝数目与其mRNA、编码蛋白CL3L1生成量及趋化效力相关关系。假定拷贝数目为1的样品相对量为1，得到结果如下:CCL3L1 mRNA的表达量与CCL3L1基因拷贝数目呈正相关(R2=0.97)，CL3L1生成量与CCL3L1基因拷贝数目呈正相关(R2=0.97)，CCL3L1基因拷贝数目与其趋化效力呈正相关关系(R2=0.94)。随着拷贝数目的增加，mRNA、编码蛋白CL3L1的生成量及趋化效力也增加，见图2。

Figure 2.Correlation between copy number of CCL3L1 and its mRNA，protein products and chemotactic effect.图2 CCL3L1拷贝数目与其mRNA、CCL3L1蛋白生成量及趋化效力的相关关系

4 CCL3L1基因拷贝数与乙肝易感性的相关性

利用Pearson's卡方检验，在自由度为9的情况下，P＜0.01，提示CCL3L1基因拷贝数与乙肝相关。运用Logistic回归校正性别与年龄后，CCL3L1拷贝数变异依然与乙肝具有相关性(P＜0.01)。

讨 论

乙肝为多因素复杂性疾病，其易感性及感染后的转归受病毒载量，暴露时间，年龄，性别，父母患病状况等因素的影响［11，12］。但正如 HIV 感染一样，机体对乙肝病毒的免疫反应及病毒在体内的复制都受宿主遗传因素的影响，故遗传学因素在其易感性及疾病转归上起着重要作用［13］。在乙肝遗传背景的研究中，HLA是最常被报道的基因［13］。

CCL3L1的拷贝数目分布在各人种中不同，我们大样本量的CCL3L1拷贝数目分析获得了比美国学者基于45例个体的结果更接近真实的分布特点，即在我国汉族人群CCL3L1基因拷贝数目的中位数为3，而非美国科学家报道的 4［7］。

CCL3L1是目前已知的存在拷贝数目变异的免疫基因之一［6，7］。Gonzalez 等［7］的研究发现 CCL3L1拷贝数目变异与HIV/AIDS易感性相关，低拷贝数的个体感染HIV的风险升高。相反，曾有报道指出高CCL3L1拷贝数目的个体，患风湿性关节炎与川崎病的风险升高［14，15］。此外，Ptacek 等［16］和Mamtani等［17］分别报道CCL3L1拷贝数目变异与系统性红斑狼疮存在相关。2010年，德国科学家报道了CCL3L1拷贝数目变异与丙型病毒性肝炎(hepatitis C)的相关关系［8］。同一年，爱沙尼亚科学家对CCL3L1拷贝数目变异与静脉吸毒者HIV的相关关系研究中，发现HBV血清学阳性能提高HIV的感染率［9］。本实验通过研究CCL3L1基因拷贝数目多态性与乙肝易感性的相关关系发现，在中国汉族人群中，低CCL3L1基因拷贝数目是乙肝发病的一个危险因素。

CCL3L1作为一种CC型强效的细胞因子，可通过与其受体(D6、CCR3、CCR5)的结合而产生生物学效应［6］。其中CCR5为HIV进入细胞的重要受体之一，有学者提出，高CCL3L1拷贝数目者之所以不易感染HIV，是由于其编码的CCL3L1与CCR5结合，封闭了HIV进入人体细胞的途径。然而，HBV病毒进入人体肝细胞的机制尚未明确，也没有研究报道肝细胞上有上述受体表达。本研究的实时荧光定量PCR、ELISA和 Transwell实验结果显示高拷贝CCL3L1能生成更多的mRNA、蛋白质，并且对淋巴细胞具有更强的趋化性。因此高拷贝的CCL3L1基因对HBV的保护作用可能是让机体生成更多的趋化因子CCL3L1，从而有助于免疫细胞发挥其保护作用。

由于我国目前还未有一套健全的乙肝疫苗注射登记系统，所以本研究在健康对照的筛选中未排除注射过乙肝疫苗者，故部分人的保护性作用可能来自于乙肝疫苗。这种在病例－对照研究中使用与病例组交叉的对照(overlapped control)已得到科学界的认可，如英国多项由Wellcome Trust Sanger Institute进行的相关关系研究均使用了生于1958年的对照(即58 birth cohort)，全然不计对照个体的患病状态(http://www.wtccc.org.uk/)。由于本项目所采用的样本量大，在这种情况下仍获得了阳性结果，这进一步证实了CCL3L1基因拷贝数目变异与乙肝的相关关系。总而言之，本研究阐明了中国汉族人群中CCL3L1基因在健康人群中的分布情况及与乙肝易感的相关关系，低拷贝数目者更易患慢性乙肝，而高拷贝数目有保护性作用，并对其可能的机制进行了初步的探讨。

［1］Feuk L，Marshall CR，Wintle RF，et al.Structural variants:changing the landscape of chromosomes and design of disease studies［J］.Hum Mol Genet，2006，15(1):R57－ R66.

［2］Redon R，Ishikawa S，Fitch KR，et al.Global variation in copy number in the human genome［J］.Nature，2006，444(7118):444－454.

［3］Skipper M.Human genomics:Structural variation catches up［J］.Nat Rev Genet，2009，10(11):740 －741.

［4］Bruce HA，Sachs N，Rudnicki DD，et al.Long tandem repeats as a form of genomic copy number variation:structure and length polymorphism of a chromosome 5p repeat in control and schizophrenia populations［J］.Psychiatr Genet，2009，19(2):64 －71.

［5］Sebat J，Lakshmi B，Malhotra D，et al.Strong association of de novo copy number mutations with autism［J］.Science，2007，316(5823):445－449.

［6］Townson JR，Barcellos LF，Nibbs RJ.Gene copy number regulates the production of the human chemokine CCL3－L1［J］.Eur J Immunol，2002，32(10):3016 －3026.

［7］Gonzalez E，Kulkarni H，Bolivar H，et al.The influence of CCL3L1 gene－containing segmental duplications on HIV － 1/AIDS susceptibility［J］.Science，2005，307(5714):1434－1440.

［8］Grunhage F，Nattermann J，Gressner OA，et al.Lower copy numbers of the chemokine CCL3L1 gene in patients with chronic hepatitis C［J］.J Hepatol，2010，52(2):153－159.

［9］Huik K，Sadam M，Karki T，et al.CCL3L1 copy number is a strong genetic determinant of HIV seropositivity in Caucasian intravenous drug users［J］.J Infect Dis，2010，201(5):730－739.

［10］中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会.病毒性肝炎防治方案［J］.中华传染病杂志，2001，19(1):56－62.

［11］Chen CJ，Yang HI，Iloeje UH，et al.Hepatitis B virus DNA levels and outcomes in chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2009，49(5 Suppl):S72－S84.

［12］Kim WR，Benson JT，Therneau TM，et al.Changing epidemiology of hepatitis B in a U.S.community［J］.Hepatology，2004，39(3):811 －816.

［13］Thursz M.Pros and cons of genetic association studies in hepatitis B［J］.Hepatology，2004，40(2):284 －286.

［14］McKinney C，Merriman ME，Chapman PT，et al.Evidence for an influence of chemokine ligand 3－like 1(CCL3L1)gene copy number on susceptibility to rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2008，67(3):409 －413.

［15］Burns JC，Shimizu C，Gonzalez E，et al.Genetic variations in the receptor－ligand pair CCR5 and CCL3L1 are important determinants of susceptibility to Kawasaki disease［J］.J Infect Dis，2005，192(2):344 －349.

［16］Ptacek T，Li X，Kelley JM，et al.Copy number variants in genetic susceptibility and severity of systemic lupus erythematosus［J］.Cytogenet Genome Res，2008，123(1 －4):142－147.

［17］Mamtani M，Rovin B，Brey R，et al.CCL3L1 genecontaining segmental duplications and polymorphisms in CCR5 affect risk of systemic lupus erythaematosus［J］.Ann Rheum Dis，2008，67(8):1076－1083.