115例急性呼吸道感染患者FluA抗原快速检测与血清抗体对比研究

王慧敏 陈杭薇 尤兰华 李雪辉 魏 娟 石伟先

流行性感冒(influenza，Flu)由流感病毒所致，具病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白(matrix protein，M)的特征，流感病毒分为甲、乙和丙型。其中最常见、毒力大的是甲型流感病毒(influenza A，FluA)［1］。2009年4月从墨西哥开始流行的新型甲型H1N1流感引起全球重视。为了探讨FluA临床可靠、快速、便捷的检测方法，我们应用胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay，GICA)对流感样症状患者鼻咽部分泌物做快速检测，并用双份血清血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)抗体做对比。现报道如下。

对象和方法

一、观察对象

收集2009年9月16日至2010年2月1日住北京军区总医院呼吸内科的115例急性呼吸道感染患者，其中男72例，女43例，年龄(60.10±21.97)岁。病种包括急性上呼吸道感染、急性支气管炎、肺炎、支气管哮喘及慢性肺源性心脏病等，未接种过流感疫苗。

二、标本采集

入院当日或次日凌晨，采集患者鼻咽部分泌物鼻咽拭子现场做GICA快速检测，同时采集急性期与恢复期双份血清(各1 mL，间隔时间为3～17天)，离心置于EP管中，4℃条件下24 h内转置-20℃保存。冻存的115例双份血清标本4℃条件下集中分次送至北京市疾病预防控制中心实验室，24 h内进行血凝抑制试验检测FluA(新型H1N1、季节性H1H1和季节性H3N2)三种HIAb亚型。以上试验均获医院伦理委员会批准。

三、研究方法

1.GICA结果

采用阿斯可来生物工程有限公司，FluA型(国药准字S20063095)，有效期内使用。本试剂盒原理:检测试纸上预先固定抗甲型流感病毒核心蛋白单克隆抗体，及胶体金标记有另一株抗甲型流感病毒核心抗原单克隆抗体，建立的双抗夹心免疫学检测方法(不能检测FluA亚型)。

分别取患者鼻咽分泌物拭子置于盛有10滴稀释液的塑料管中，充分挤压，使分泌物充分溶于稀释液中，将鼻咽拭子尽量拧干取出;再取溶有患者鼻咽分泌物的稀释液滴入FluA检测试纸卡加样孔中四滴，使试纸充分浸湿，15 min观察结果:出现两条显色带者为阳性，一条显色带者为阴性。GICA法检测结果，见图1。

图1 GICA法检测结果直观图Figure 1 The Pictorial diagram of inspection results by GICA method

2.HI结果

用HI法检测FluA(新型H1N1、季节性H1H1和季节性H3N2)三种HIAb亚型。抗原病毒株(流感病毒抗原A1/天津津南/15/2009、A/SiChuan/SW1/2009、A3/福建同安/196/2009)及HI法所需材料均由北京市疾病预防控制中心提供。试验结果以抗体效价≥1∶40视为有保护性［2］，双份血清抗体水平≥4倍增高作为阳性(金标准)，抗体水平＜1∶10者，均以1∶5替代。

四、统计学方法

采用SPSS17.0统计软件包，制作2×2列联表，求Kappa值，对两种方法做一致性检验，并进行配对设计χ2检验，计算GICA法的敏感度、特异度、Youden指数等。对计数资料进行χ2检验。

结 果

一、GICA法

115例流感样症状患者鼻咽拭子标本进行FluA的GICA法快速检测，阳性为21例，阳性率18.3%(21/115)。阳性结果病种分布及检出时间，见表1。

二、HI法

1.年龄和病种分布

115例双份血清标本HI抗体滴度≥4倍增高者共22例，＜65岁者占到7/22，≥65岁者占15/22。其中13例为肺炎(其中重症肺炎9例，双侧肺炎3例，间质性肺炎1例)，5例为肺心病，1例肺癌，1例支气管扩张症，1例肺结核，1例急性咽峡炎。

2.亚型和时间分布

FluA(新型H1N1)检出率为4.3%(5/115)，FluA(季节性H1N1)检出率为2.6%(3/115)，FluA(季节性H3N2)检出率为6.1%(7/115)，FluA混合感染检出率为6.1%(7/115)。HI法检测FluA亚型及时间分布，见表2。

三、GICA法与HI法比较

1.两种方法检测结果分析

115例患者同时做FluA抗原GICA法快速检测与双份血清抗体检测，两种方法的检出结果(见表2)行McNemar χ2检验，P=1.000，说明两种方法的阳性率差异无统计学意义。两种方法一致性检验结果:Kappa系数为0.628，P=0.000，两种检测方法的吻合程度具有统计学意义。但通常Kappa系数值大于0.7说明吻合程度比较好。FluA的两种检测方法检测结果，见表3。

表1 GICA法检测FluA结果阳性标本的采集时间及病种分布Table 1 The entity distribution and gather time of FluA positive cases detected by GICA onethod

表2 HI法检测FluA亚型及时间分布Table 2 The FluA subtype and time distribution detcted by HI method

表3 FluA的两种检测方法检测结果Table 3 The typical values of two test methods of FluA

2.筛检试验评价指标及筛检结果临床意义估计

以检测FluA的HI法作为金标准，对GICA法进行评价，检测FluA的特异性93.5%，敏感性68.2%，误诊率 6.5%，漏诊率 31.8%，约登指数 0.617，符合率 84.3%。

讨 论

20世纪以来人类遭受了4次FluA大流行，致使数千万人丧命。100多年以来人类遭受了4次FluA大流行，致使数千万人丧命。第一次大流行发生于1918年至1919年，称为“西班牙流感”(Spanish influenza)，被认为是人类有史以来最大的一次浩劫，患病人数在5亿以上，导致4000多万人死亡，而且死亡病例多为青壮年。20世纪30年代末，对1918年流感大流行幸存者的血清进行抗体检测，证实1918年流行的毒株是H1N1病毒［3］。第二次大流行发生于1957年，称为“亚洲流感”(Asian influenza)，最早出现于中国西南部，由H2N2亚型病毒引起，这一亚型后被证实由人H1N1亚型流感病毒与禽源流感病毒3个基因片段重组而来，死亡病例多发生在儿童和老年人［4］。第三次大流行发生于1968年，称为“香港流感”(Hong Kong influenza)，由H3N2亚型病毒引起，该病毒在中国香港首次分离，该病毒的HA和PB1两个基因节段来自禽流感病毒，其他六个基因节段来自当时流行于人群的 H2N2病毒［5］。第四次大流行发生于1977年，称为“俄罗斯流感”(Russian influenza)，由H1N1亚型引起，该流感最早是在我国丹东、鞍山和天津等地区暴发，该病毒主要侵袭25岁以下青年人和中小学生［6］。

2009年4月，一种先前未曾报道的毒株从墨西哥人感染病例中被分离出并鉴定为新型甲型H1N1流感病毒株，这种病毒随后波及超过90个国家［7-10］。

随着抗流感病毒特效药“盐酸奥斯他韦”的面世，在流感的早期诊断和治疗上对广大临床医生提出了新的要求。要早期确诊流感除了临床症状之外必须辅以病毒的试验室检测结果。细胞培养方法、PCR法和血清学检测中的血凝抑制试验目前公认为确诊流感病毒感染的“金标准”。但以上方法费时费力，技术条件要求高不适用于基层医院;检测双份血清的血凝抑制试验属于回顾性研究，结果滞后，在临床诊断上没有应用价值。流感的诊治通常依靠医生的临床经验，容易造成误诊和滥用抗生素。

以膜为固相载体的胶体金快速诊断技术是近年来发展起来的一种体外诊断技术，由于其快速、便捷、结果判断直观使其在医学检验领域得到了迅猛的发展，也开始应用于流感临床初步诊断。临床医师依据检测结果能及时判断患者是否感染了流感病毒，从而尽早开展针对性的治疗，对控制流感的扩散，减少疾病造成的危害以及抗生素滥用具有重要的意义。

GICA法与双份血清抗体法相比，二者一致性较好。如果一位发热患者GICA法被检测FluA抗原阳性，同时患者双份血清FluA特异性抗体又达到4倍增高，则可认为此次FluA即为患者此次发病的致病原，而非上呼吸道的定植病毒。

2009年10月以来，北半球已经进入秋冬季，美国、日本、欧洲各国、中国等地甲型H1N1流感活动呈快速上升趋势，流行高峰较往年提前2个月左右，并持续快速上升，流行强度超过往年季节性流感的秋冬季流行高峰，2009年12月开始下降［11］。本项研究中GICA法和HI法检测FluA，阳性结果主要出现在2009年9月至12月，符合FluA的这一流行趋势。病种上集中在肺炎和慢性肺源性心脏病患者组，与国家卫生部颁布的甲流诊断标准［12］中提到慢性呼吸系统疾病者为高危人群是符合的。2009年FluA感染中FluA(新型H1N1)亚型检出例数最多，符合新型甲型H1N1病毒为2009年度流行株的趋势。而FluA(季节性H1N1、H3N2)也有检出，提示季节性甲型流感散发流行是不容忽视的。2010年同期，FluA(新型H1N1)以混合感染形式与FluA(H1N1)和(或)FluA(H3N2)散发存在。这与WHO 2010年8月10日在日内瓦召开会议宣布世界现已处在流感大流行后期并预计2009年H1N1流感病毒会在未来数年内以季节性病毒的方式继续传播相符合。

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