双水相萃取技术的应用进展

范 芳

(广东石油化工学院化学与生命科学学院，广东 茂名 525000)

双水相萃取是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。双水相萃取技术的真正应用是在20世纪中叶，1956年，瑞典伦德大学的Albertsson成功地利用双水相体系分离叶绿素，解决了蛋白质变性和沉淀的问题[1]。1979年，德国Kula等将双水相萃取技术应用于生物酶的分离，为以后双水相萃取技术在生物蛋白质、酶分离纯化方面的应用奠定了基础[2]。迄今为止，双水相萃取技术已被成功应用于生物工程、药物提取、金属离子分离等方面。尽管其已发展成为一种相对比较成熟的技术，但仍然有值得深入研究与完善的方面。作者在此主要介绍了双水相萃取的基本要点及应用特点，综述了双水相萃取技术在生物工程、药物成分提取分离等方面的应用。

1 双水相萃取的基本要点

1.1 双水相萃取的原理

双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的[3]。

1.2 双水相的种类

双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。最常见的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等)体系，其次是聚合物/低分子量组分、离子液体体系和高分子电解质/高分子表面活性剂体系。此外，还有被称为智能聚合物的双水相体系，智能聚合物又称刺激-响应型聚合物(Stimulus-responsive polymers)或环境敏感聚合物(Environmentally-sensitive polymers)。智能聚合物是一种功能高分子材料，当外界环境(如温度、pH值、离子强度、外加试剂、光、电场或磁场等)发生微小变化时，聚合物分子的微观结构会发生快速、可逆的转变，使其从亲水性变为疏水性。智能聚合物的双水相体系有：温度敏感型双水相体系、酸度敏感型双水相体系、光响应型双水相体系、亲和功能双水相体系[4]。

2 双水相萃取技术的特点

双水相萃取技术设备简单、在温和条件下进行简单操作就可获得较高的收率和纯度。与一些传统的分离方法相比，双水相萃取技术具有以下特点[5，6]：

(1)双水相体系中的传质和平衡速度快，回收率高，分相时间短，自然分相时间一般为5～15 min，相对某些分离过程，可以实现快速分离，且能耗较低。

(2)两相间的界面张力小，一般为1×10-7～1×10-4mN·m-1，比一般的有机萃取两相体系界面张力(1×10-3～2×10-2mN·m-1)低得多，因此两相易分散，有利于强化相际间的物质传递，整个操作过程可以在常温常压下进行，不会引起生物活性物质失活或变性。

(3)分离过程更经济，与常用固液分离方法相比，可省去1～2个分离步骤。

(4)两相的溶剂都是水，上相和下相的含水量高达70%～90%(质量分数)，不存在有机溶剂残留问题。

(5)聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度以及体系的pH值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响，因此，可以采用多种手段来提高选择性和回收率。

(6)易于连续化操作，设备简单，并且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。

3 双水相萃取技术的应用

双水相萃取技术越来越受到人们的青睐，广泛应用于生物、医学、环境科学等各大领域，近三年来，双水相萃取技术的应用更加频繁。

3.1 生物工程

3.1.1 萃取分离酶

已有较多报道采用双水相萃取技术分离各种酶，如蛋白酶、木聚糖酶、Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶、低温α-淀粉酶、壳聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氯过氧化物酶等。

张兰威等[7]采用双水相萃取技术分离提取风干香肠中蛋白酶，确定双水相体系组成(质量分数)为PEG1000 20%和MgSO425%，在此体系中风干香肠的蛋白酶主要分布在上相，最高酶活为12.37 U·μg-1，纯化倍数为4.61，回收率为85%。

苏玉春等[8]采用双水相萃取法从黑曲霉AS3.4309的发酵液中提取木聚糖酶，得到双水相体系的最佳组成：选用PEG4000，其质量分数为19%，磷酸氢二钾质量分数为10%。在此条件下，木聚糖酶的提取效果较好，分配系数和上相产率分别为6.23和88.67%。

王蕾等[9]确定双水相萃取体系为：PEG质量分数30%、NaH2PO4质量分数20%、pH值6，在此条件下Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶经硫酸铵沉淀和双水相萃取两步纯化的纯化倍数达到最大，较Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶粗酶纯化了22倍。Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶纯酶为低温碱性脂肪酶，最适反应温度为15 ℃，最适pH值为9.5，相对分子质量为3.58×104。

房耀维等[10]利用聚乙二醇/磷酸盐双水相体系从PseudoalteromonasarcticGS230发酵液中直接萃取分离低温α-淀粉酶。结果表明，在pH值5.0的15% PEG1000/15%磷酸盐双水相体系中，低温α-淀粉酶的纯化倍数及回收率分别为4.8和87%。

周念波等[11]采用PEG600/(NH4)2SO4双水相体系直接从Bacillussp.LS发酵液上清液中分离壳聚糖酶。得到室温下双水相萃取最佳条件为：PEG600 20%、(NH4)2SO420%、NaCl 0.1%、pH值6.0，在此条件下，壳聚糖酶分配系数达5.91，萃取率达88.7%。

舒国伟等[12]利用PEG4000/(NH4)2SO4双水相体系萃取纤维素酶。结果表明，双水相体系的组成(质量分数)为(NH4)2SO48%、PEG4000 26%、pH值4.8时，分配系数为5.21，萃取率为79.4%。

张娟等[13]研究了果胶酶的双水相萃取，结果发现，在双水相体系组成(质量分数)为PEG1000 27%、硫酸铵19%、氯化钠0.002%、pH值5.0时，果胶酶的萃取效率较好，分配系数最高达14.0。

陈利梅等[14]采用双水相体系对葡萄糖氧化酶进行萃取，结果发现，葡萄糖氧化酶在25% PEG4000和10%硫酸铵的双水相体系中可获得较高的萃取率，达81.11%，分配系数为0.134。

朱旭国等[15]利用亲水聚合物PEG6000在高离子强度下失水沉淀夹带酶蛋白的特点，结合PEG/(NH4)2SO4双水相萃取得到高浓度酶蛋白，再经SephadexG-75柱层析纯化得到高纯度酶样品。结果表明，饱和度60%的(NH4)2SO4溶液可使PEG6000夹带沉淀出总酶活力95%的氯过氧化物酶，酶在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中上下相分配率达到0.228以下，回收率达到65.2%，纯度提高了7.4倍。

3.1.2 萃取分离蛋白质

近几年来，已经成功地利用双水相萃取技术分离出牛血清白蛋白、藻蓝蛋白、藻胆蛋白、血红蛋白等。

王军等[16]研究了新型离子液体N-乙基-N-丁基吗啉四氟硼酸盐([Nebm]BF4)和KH2PO4形成的双水相体系对牛血清白蛋白(BSA)的萃取行为，结果表明，当KH2PO4的加入量为85 g·L-1、离子液体浓度为200～250 g·L-1、BSA的浓度为60～120 mg·L-1、溶液pH值为4.5～7.0时，萃取率达98.0%以上。

王巍杰等[17]确定双水相体系组成(质量分数)为PEG2000 16%、酒石酸钾钠25%、pH值6.0，在此体系中藻蓝蛋白主要分布在上相，最高纯化倍数为3.69，分配系数为20.7，回收率为94.56%。多次双水相萃取有利于藻蓝蛋白纯度提高，3次双水相萃取后，藻蓝蛋白纯化倍数高达4.15。

谢云飞等[18]应用双水相体系分离血红蛋白(HB)。结果表明，最佳PEG双水相体系为：PEG400质量分数20%、(NH4)2SO4质量分数20%、pH值7、温度30 ℃。在此条件下，HB分配系数达到65，回收率达到89.5%，纯度达到80.5%。

3.1.3 萃取分离小分子物质

双水相萃取技术除了能分离大分子物质外，还可以萃取分离小分子物质，如萃取大豆苯丙氨酸、发酵液中谷胱甘肽等。

孙晨等[19]采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基硫酸钠(SDS)表面活性剂形成双水相体系，研究了大豆蛋白水解液中L-苯丙氨酸在CTAB/SDS双水相体系中的分配及萃取效果。结果表明，当双水相体系CTAB与SDS摩尔比为0.256、提取液初始苯丙氨酸浓度为0.02 g·L-1、Na2SO4浓度为0.23 mol·L-1时，萃取率最高，达96.9%。

吴祥庭等[20]选用PEG/四水合酒石酸钾钠双水相体系提取发酵液中谷胱甘肽，确定最佳提取条件为：15% PEG/13%四水合酒石酸钾钠双水相溶液10 mL、pH值6.7、温度63 ℃、发酵液加入量1 mL。此时谷胱甘肽分配系数为3.5，萃取率为84.13%。

3.1.4 萃取分离抑制剂

α-淀粉酶抑制剂可以用来治疗糖尿病、肥胖症以及合成干扰内源性甘油三酯，还可以用作杀虫剂。研究人员成功地利用双水相萃取技术从白芸豆及银针茶中分离纯化出α-淀粉酶抑制剂。

张佰鹏等[21]确定白芸豆中α-淀粉酶抑制剂提取的最佳条件为：PEG质量分数12.0%、(NH4)2SO4质量分数13.3%、NaCl质量分数0.003%，在此条件下，分配系数、相比和活力回收率分别为4.40、0.57、71.41%。

彭佳黛等[22]研究了PEG2000/(NH4)2SO4双水相体系分离银针茶α-淀粉酶抑制剂，结果表明，α-淀粉酶抑制剂主要分配于上相，当PEG2000的质量分数为16%、(NH4)2SO4的质量分数为14%、NaCl质量分数为0.0013%时，α-淀粉酶抑制剂的萃取率最大。

3.2 医药学

双水相萃取技术已经悄然渗透到药物成分的分离中，如萃取三七皂苷、四环素、橙皮苷、杜仲黄酮、灯盏花素、桃叶珊瑚甙、芦荟蒽醌、青霉素等，其最佳提取条件如表1所示。

表1 双水相体系提取药物成分

3.3 环境科学

当水中含过量的锌、铅、铬等金属元素时，严重影响生态平衡；含有酚类时，引起农作物的减产甚至枯死；含土霉素等抗生素药物时，通过生物富集对生态系统造成危害。通过双水相体系可以测定水中酚类、土霉素、锌、铅、铬等物质的含量。

曹文等[31]将丙醇/硫酸铵双水相体系应用于焦化厂废水中酚类物质的萃取分离。对于50.0 mL含酚废水，最佳硫酸铵用量为18.0 g、正丙醇用量为30 mL。

张星刚等[32]采用聚乙二醇/无水硫酸钠双水相体系萃取光度法测定锌，结果表明，当PEG2000溶液用量为4.5 mL、缓冲溶液pH值为7.4时，萃取率最高。还通过研究二苯碳酰二肼(DPC)-铬(Ⅵ)配合物在PEG2000/Na2SO4双水相体系中的显色和萃取分离条件，建立了集萃取分离和Cr6+测定于一身的双水相萃取光度分析方法。结果表明，PEG2000溶液用量为4.0～6.0 mL、Na2SO4用量为1.2 g、DPC用量为0.5 mL时，效果最佳。

3.4 与其它技术结合应用

双水相萃取技术有其独有的优点，如能与其它技术结合应用，萃取分离效果更佳。双水相萃取技术与超声波、微波、壳聚糖沉淀相结合应用的研究已经比较成熟，其中与超声波分离技术结合应用得最多，具体情况如表2所示。

表2 双水相萃取与其它技术结合应用

4 结语

双水相萃取技术是近年来新发展起来的分离技术，所需设备简单、条件温和、易于操作，且可以获得较高的收率和较纯的有效成分，与常规的有机溶剂萃取技术相比较，最大的优势在于可保持生物物质的活性及构象，因此在生物工程、药物分析、环境科学等方面有着广阔的应用前景。然而，相关研究和应用还不够深入，一些技术难题还有待解决。双水相萃取技术的发展趋势为：(1)解决易乳化、相分离时间长、成相聚合物的成本较高、水溶性高聚物粘度较大且不易定量控制等问题；(2)开发新型优质的双水相体系；(3)进一步拓宽应用领域；(4)与其它技术结合的多元化利用。

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