挥发性有机物对大鼠皮质星形胶质细胞体外毒性的实验研究

张焕珠，宋伟民

（上海市黄浦区疾病预防控制中心，上海 200126）

挥发性有机化合物（VOCs）是指在常温下，沸点50℃～260℃的各种有机化合物。VOCs按其化学结构，可以进一步分为烷类、芳烃类、酯类、醛类和其他等。目前已鉴定出的有300多种，最常见的有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷、二异氰酸酯（TDI）、二异氰甲苯酯等。VOCs是造成室内空气污染的主要原因之一。挥发性有机物为亲脂性化合物，脑组织是其主要靶器官之一，而且中枢神经系统对外界危害因素极为敏感，当受到侵袭时常首先受累。星形胶质细胞的作用不仅仅是支持和营养神经元，还参与神经元发育至神经损伤的各种复杂过程。星形细胞培养具有细胞单一、观察直接等优点，已成为筛选神经毒物，探索毒作用机制的重要方法［1－2］。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和器材

高糖型DMEM 培养基（Gibco公司），多聚－L－赖氨酸、胎牛血清（Hyclone公司），L－谷胺酰氨（上海伯奥生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物有限公司），青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）、MTT，酶标仪，Beckman液体闪烁测定仪，超净工作台。CO2细胞培养箱（Napco，法国），倒置显微镜（Leica，德国），UnicoTM2000型分光光度计，6孔、24孔、96孔培养板（Costar）。实验动物：SD新生大鼠（1～3天龄），由上海医科大学动物部提供。

1.2 分离培养方法

选取出生2d内的正常SD仔鼠，颈动脉放血，取脑，将皮层组织移入D－Hank＇s液中，用吸管轻轻吹打，放置5min，取上清，进行离心（5min，1500转／min）。弃上清，加入DMEM营养液（每升含6g葡萄糖，4mmol L－谷胺酰氨，10mM HEPES，1×105U青霉素，100mg链霉素，150mL胎牛血清），调整细胞浓度为1×106／mL，接种于培养瓶中，将此浓度细胞悬液接种于预先铺好多聚－L－赖氨酸的培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育，以后每周换液2～3次。

1.3 挥发性有机化合物储备液处理

将分析纯试剂苯、甲醛、乙苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯配制成混合物（甲苯34.1%、乙苯19.5%、二甲苯31.7%、苯7.3%、苯乙烯7.4%、甲醛9.3%），调节溶液pH 值为6.0，0.25μm滤膜滤过除菌。

1.4 MTT实验

MTT［32（4，52二甲基噻唑）22，52二甲基四唑溴盐］（Sigma）首先用 HBSS配制成5g／L的储备液，0.25μm 滤膜滤过除菌，4℃避光可保存7天，使用前稀释至所需工作液浓度。细胞培养3d，加入含不同挥发性有机物浓度的溶液，使终浓度为低浓度组（VOCs 3mmol／L），中浓度组（VOCs 6mmol／L），高浓度组（VOCs 9mmol／L）培养3d，每孔加入MTT15μL（115g／L），37℃孵育4h，弃去上清，每孔加入DMSO 100μL，室温下放置10min，测定MTT光吸收值。按如下公式计算细胞活性：细胞活性（%）＝OD暴露－OD空白／OD对照－OD空白。

1.5 LDH实验

乳酸脱氢酶（LDH）释放量的测定将纯化后的星形胶质细胞每毫升约1.3×106的细胞数，接种于24孔板中，培养3d后分组加入VOCs储备液即对照组，使终浓度为对照组（VOCs 0mmol／L）、低 浓 度 组 （VOCs 3mmol／L）、中 浓 度 组 （VOCs 6mmol／L）、高浓度组（VOCs 9mmol／L）。培养72h后，吸取每孔板中的全部培养液，进行LDH活性（U／L）测定。

2 结果

2.1 形态学观察

与挥发性有机物共同培养24h后，细胞形态未见明显异常，48h后细胞开始失去正常的形态，变为多角形或不规则形，细胞形态随着染毒浓度增加改变加重，细胞也变得稀疏起来。

2.2 MTT实验

从图1中可以看出，随着染毒浓度的增加，细胞活性随之下降，在6mM和9mM组下降水平与对照组比较，有显著性差异，P值分别＜0.05和＜0.01。

图1 VOCs暴露对细胞活性的影响

2.3 LDH实验

图2显示了VOCs对星形胶质细胞外乳酸脱氢酶的影响，可以看出，随着染毒浓度的增加，细胞膜受损程度增加，细胞外乳酸脱氢酶含量增加，在9mm组达到显著差异（P＜0.01）。

图2 VOCs暴露对细胞外LDH含量的影响

3 讨论

星形胶质细胞是在中枢神经系统受到损害时，最早和最显著细胞反应之一［3］。这种反应表现在神经胶质酸性蛋白（GFAP）的过度表达上。GFAP免疫反应阳性细胞的增加不是由于星形胶质细胞的增殖，而是每个星形细胞GFAP表达的增强。关于挥发性有机物中甲苯的神经系统毒性研究较多，在体外条件培养下，接触甲苯的神经元和星形胶质细胞，均表现了酶活性的改变。甲苯抑制神经突触体和星形胶质细胞膜的Na＋，K＋－ATP酶和 Mg2＋－ATP酶活性，使膜脂流动性增加［4］。Engelke等［5］将大鼠脑皮层神经细胞突触体暴露于甲苯，结果ATP酶活性呈线性下降，在最高浓度组（8mmol），ATP酶活性下降了近50%，乙酰胆硷脂酶活性也呈下降趋势。也有研究发现，星形细胞在体外接触甲苯1h，Na＋，K＋－ATP酶活性轻度下降，与对照组比较无显著性差异，而Mg2＋－ATP酶活性明显低于对照组，呈剂量－效应关系（P＜0.005）［6］。星形细胞是维持神经元正常稳态环境的细胞，细胞膜ATP酶起着重要作用。甲苯可通过酶的抑制作用而干扰星形细胞的稳态调节功能，并对神经系统发生毒作用。大鼠暴露于甲苯，可使海马、小脑以及齿状回反应性的神经胶质增加，GFAP表达增加［7－8］，而在丘脑部位GFAP表达减少［9］。体外培养的星形胶质细胞急性暴露于甲苯，细胞凋亡增加，细胞分裂素（丝裂原）活化蛋白激酶（MAPK）活性增加，可能是一种保护性反应［10］。本次实验结果表明，暴露于挥发性有机物，可对星形胶质细胞的生长、形态造成一定损害，表现为细胞形态为多角形或不规则形，细胞较对照组稀疏，并随浓度增加形态改变加重，从MTT实验结果可以看出暴露于VOCs，细胞活力下降。本次实验可以看到细胞外乳酸脱氢酶活力随染毒浓度增加而升高，说明VOCs可以使星形胶质细胞膜完整性受损。

综合本次实验结果，VOCs可以对星形胶质细胞造成毒性损害，从而影响星形胶质细胞对神经元的稳态调节、营养支持作用以及神经递质调节作用，导致脑组织正常的结构和功能改变，引起一系列神经系统损害症状。

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