豚鼠心肌细胞中Kir2.1对内向整流钾电流组成的贡献

杨慧芳

心肌细胞内向整流钾电流Kir主要参与心肌细胞动作电位的4级静息电位过程，与心肌细胞动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)的长短密切相关，对维持心肌细胞正常生理功能有重要的作用，IK的异常也常常是心律失常的因素之一［1］。IK主要维持心肌细胞的静息膜电位，是动作电位的重要组成部分，是维持心室肌细胞正常功能活动的重要电流。本文研究小鼠心肌细胞内向整流钾电流Kir2.1的在静息膜电位中的参与与在所有内向整流钾电流中所占比例。

1 材料与方法

1.1 实验动物 豚鼠8只，体重200～250 g。本实验中豚鼠由河北医科大学动物实验中心提供。

1.2 试剂与溶液

1.2.1 试剂:Ⅱ型胶原酶(collagenase typeⅡ)为 GIBCO公司生产，其他试剂均为国产分析纯。

1.2.2 溶液:①无钙台氏液:NaCl 137.7 mmol/L，NaOH 2.3 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl 21 mmol/L，N-(乙羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L(用NaOH调 pH 值 至 7.4);②KB 液:KCl 83 mmol/L，K2HPO430 mmol/L，MgSO45 mmol/L，KOH 2 mmol/L，丙 酮 酸 钠5 mmol/L，牛 磺 酸 20 mmol/L，葡 萄 糖 10 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，(用 KOH 调 pH 值至 7.2);③记录Kir2.1的电极内液;④记录 Kir的电极外液:NaCl 150 mmol/L，KCl10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl25.4 mmol/L，用NaOH调pH值至7.4。

1.3 仪器 膜片钳放大器Axon 200B为美国Axon公司产品;电极拉制器和三位操纵器均为Sutter公司产品;倒置显微镜TE2000-S为Nikon公司产品。

1.4 方法 豚鼠心肌细胞的急性分离:将豚鼠麻醉后快速开胸取出心脏，至于冰无钙台式液中进行主动脉插管，连于Langendorff灌流装置上，进行恒压恒温逆行灌流。灌流液温度37℃，流速7 ml/min，用前用100%O2饱和。先用无钙台氏液灌流5 min，冲洗心脏中残留的血液，然后灌以含12 mg/mlⅡ型胶原酶的无钙台氏液，循环灌流心脏1 520 min，之后再用无钙台氏液灌流，以冲洗心脏中残留的胶原酶。将消化后的心肌剪下，置于KB液中剪碎，轻轻吹打至细胞分散。待细胞沉降后置换KB液，室温下静置1 h后用于膜片钳记录。

1.5 膜片钳记录 实验采用标准全细胞膜片钳方法记录心肌细胞Kir2.1电流。将部分静置的细胞放入浴槽中，待细胞贴壁后灌以外液。应用电极拉制仪将薄细毛坯电极拉制成应用电极并抛光待用。将电极接触与细胞表面给予一定负压，在细胞膜表面与电极尖之间形成紧密的封接，达GΩ。施加更大的负压使细胞膜破膜，补偿电极电容和串联电阻，达到全细胞记录模式(whole-cell recording)。记录豚鼠心室肌细胞Kir2.1电流，并给予500 mmol/L BaCl2溶液，观察与记录Kir2.1的变化，并统计Kir2.1在心肌细胞内向整流钾离子电流中所占比例。

1.6 统计学分析 应用Clampfit 9.0(美国Axon公司)和Origin 7.0统计软件，实验数据以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ba2+对IKir2.1的作用 应用全细胞膜片钳记录Ba2+对豚鼠心肌细胞中Kir2.1的作用。全细胞记录Kir2.1的protocol是采用牵制电压为－120 mV逐渐升至40 mV再回到－120 mV。IK的电压依赖性研究应用牵制在－80 mV，再阶跃到80 mV，再回到 －80 mV，依次从80 mV以10 mV降低至－30 mV。记录到IKir2.1明显被抑制，抑制率为(81±7)%。见图1。

2.2 Ba2+抑制豚鼠心肌细胞Kir2.1的统计 见图2。

图1 500 mmol/L的Ba2+对Kir2.1 的作用

图2 Ba2+抑制豚鼠心肌细胞统计图

3 讨论

Kir2.1主要分布于心肌细胞，对维持心肌细胞的静息电位以及心肌复极过程起着重要的作用。其异常是导致心律失常的重要机制之一，同时也是导致其他器官异常的重要因素，例如它参与帕金森病形成等［1］，国内外研究人员对于Kir2.1的调节机制研究已经有很多的基础。对于心肌细胞内向整流钾电流中Kir2.1所占比例，有诸多的研究［2］。心肌细胞的内向整流钾离子电流由多种钾离子电流组成，心肌细胞的内向整流钾离子电流由多种钾离子电流组成，在心脏的生理活动中起举足轻生的作用［3－5］，本文主要研究Kir2.1对豚鼠心肌细胞内向整流钾离子组成的贡献。通过实验研究，我们发现Kir2.1在豚鼠心肌细胞中所占比例，即被Ba抑制的电流比例，为(81±7)%。说明Kir2.1是心肌细胞内向整流钾离子电流的主要组成部分，并且还有其他的电流组成部分，他们在维持心肌细胞的正常生理功能方面起着重要作用。

1 Regina PM，Günter S，Tobias G，et al.Heteromerzation of Kir2.x potassium channels contributes to the phenotype of Andersen’s syndrome.Physiology，2002，99:7774-7779.

2 GX Liu，C Derst，G Schlichthrl，et al.Comparison of cloned Kir2 channels with native inward rectifier K+channels from.Physiol，2001，532:115-126.

3 Jongsma HJ，Wilders R.Channelopathies:Kir2.1 mutations jeopardize many cell functions.Curr Biol，2001，11:R747-750.

4 Abraham MR，Jahangir A，Alekseev AE，et al.Channelopathies of inwardly rectifying potassium channels.FASEB J，1999，13:1901-1910.

5 He Y，Pan Q，Li J，et al.Kir2.3 knock-down decreases IK1 current in neonatal rat cardiomyocytes.FEBS Letters，2008，582:2338-2342.