一株新城疫病毒的分离鉴定
2011-06-21邹立宏瑞普保定生物药业有限公司
文│邹立宏 [瑞普(保定)生物药业有限公司]
翟含流(河北省保定市北市区动物卫生监督)
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种侵害禽类的急性、高度接触性传染病。2011年6月,某肉鸡养殖场爆发了疑似新城疫的病情,鸡群34日龄发病,表现为精神沉郁、食欲不振,采食量下降50%、并伴有严重的呼吸道症状,拉绿色粪便。发病率20%左右,死亡率14%左右。剖检发现气管环出血、肌胃底部、腺胃潮红,十二指肠、卵黄蒂附近有枣核状溃疡和出血,盲肠扁桃体出血,直肠条状出血,肾脏肿胀。为了对该病作出准确诊断并制定出有效的防控措施,采集病鸡气管、肾脏、脑等组织,进行病原的分离与鉴定。
一、材料与方法
1.材料。
(1)SPF鸡胚及SPF鸡。9~11日龄SPF鸡胚和SPF鸡均购自北京梅里亚-维通实验动物技术有限公司。
(2)标准阳性血清。ND标准阳性血清、禽流感(A1)H9、H5标准阳性血清,均购自中国农科院哈尔滨兽医研究所。
2.方法。
(1)病毒分离。无菌采集病死鸡气管、肾脏、脑,放入研钵中剪成小块,加入灭菌的PBS冲洗,洗去红细胞,反复2~3次。然后将病料加入研磨器中磨碎,加少量灭菌PBS液稀释,反复冻融3次后,5000转/分钟离心10分钟,取上清,用0.22微米的滤膜滤过除菌,将滤液接种10日龄SPF鸡胚,37℃培养,无菌收集尿囊液(弃去24小时死亡鸡胚),-20℃保存。
(2)血凝性检测。收获鸡胚尿囊液,进行血凝(HA)试验。
(3)血凝抑制试验。按常规将具有血凝性的病毒,分别与新城疫、禽流感(H9或H5)阳性血清进行交叉HI试验。
(4)病毒毒力的测定。按常规方法,分别测定鸡胚半数致死量(ELD50)、最小致死量致死鸡胚的平均时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)。
(5)动物回归试验。取10只35日龄的SPF鸡,将分离毒经滴鼻、点眼途径攻毒,每只鸡攻10-5ELD50/0.1毫升,观察鸡群变化。
二、结果
1.病毒分离鉴定。SPF鸡胚在接种分离病毒后48小时内死亡,死亡鸡胚全身严重出血、水肿,肝脏有坏死和出血点。鸡胚尿囊液的血凝价为28,和抗NDV标准阳性血清、抗AIV H9亚型与H5亚型标准阳性血清及阴性血清进行HI试验,结果见表1。
表1 SD1106株尿囊液和参考血清的HI试验结果
2.病毒毒力的测定。新城疫分离株的ELD50为10-7.74;MDT为51.7小时(强毒40~60小时);ICPI为1.91(1.6~2.5),由此可见,该新城疫分离株为强毒。
3.动物回归试验。10只SPF鸡,在攻毒后48小时左右鸡只出现精神沉郁,表现为闭眼、嗜睡、不愿行动,采食下降,并出现严重的呼吸道症状, 144小时内全部死亡,剖检出现典型的新城疫症状:腺胃乳头点状出血、十二指肠出血、卵黄蒂、回肠处的淋巴滤泡出血、盲肠扁桃体出血、气管内有黏液、气管环出血。
三、讨论
本研究通过HA-HI试验和动物回归试验,证明分离到的毒株为新城疫病毒,通过毒力测定,MDT为51.7小时,ICPI为1.91。根据目前NDV毒力判定标准MDT40~60小时为强毒,ICPI1.6~2.5为强毒。分离到的毒株为新城疫强毒株。
新城疫的发生与流行与日常的饲养管理、疫苗的种类、免疫程序等有很大关系,同时,新城疫病毒发生部分抗原变异也可能是一个重要因素。曹殿军等对我国分离株进行了系统的分析,我国流行的NDV既有基因I、II、III、IV、V、VI,又有新的基因VII、VIII型的流行,而我国目前使用的疫苗大多属于基因I、II,与一些流行毒株基因型有较大不同,所以用常规疫苗进行鸡群的免疫不能获得有效的保护。