乳酸杆菌的分离、鉴定及体外拮抗试验

芦 珂

（四川省雅安职业技术学院药学检验系，四川 雅安 625000）

为了筛选性状优良的多种菌株，开发出多种效果优良的微生态制剂，本试验针对乳酸杆菌对大肠杆菌的生物拮抗作用，进行微生态制剂菌种筛选的第一步工作，即体外试验，以判断候选菌是否表现出对病原菌的拮抗作用，为后续试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 培养皿、移液管、牛津杯、微型发酵管（空管）、针头、试管、蒸馏水、三角棒、微量加样枪枪头、注射器、离心管等器具，均已作高压湿热灭菌。

1.1.2 培养基 LBS乳酸杆菌选择培养基的制备：蛋白胨2 g、牛肉膏2 g、酵母浸膏1 g、葡萄糖4 g、醋酸钠1 g、吐温-80 0.2mL、磷酸氢二钾0.4 g、枸橼酸三氨0.4 g、七水硫酸镁0.04 g、四水硫酸镁0.01 g、琼脂粉1.6g、蒸馏水200mL。混合以上成分，加热溶解、冷却后，pH值调至6.0～6.5，121℃灭菌20min。

EMB培养基的制备：蛋白胨2 g、乳糖2 g、磷酸氢二钾 0.4 g、伊红 0.08 g、美蓝 0.013 g、琼脂粉 1.6 g、蒸馏水200mL。除伊红、美蓝外将其余成分混合于200mL水中，加热溶解，调至pH为7.2，再分别加入伊红、美蓝混匀，121℃灭菌15min。

营养琼脂培养基的制备：牛肉膏 1g、蛋白胨2g、氯化钠1g、琼脂粉1.6g、蒸馏水200mL。于200mL水中加入以上营养成分，加热煮沸使其溶解，调整pH值至7.6，121℃灭菌15min。成分中去除琼脂粉即为营养肉汤。

糖醇发酵培养基的制备：蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1g、吐温-80 0.1mL、糖醇类（棉籽糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、山梨醇）各2 g、蒸馏水200mL。调pH值至7.0，灭菌后，加入1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL，然后分装（无菌操作），制成含不同糖或醇的发酵管培养基。

七叶苷、精氨酸微量发酵管：购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸杆菌的分离纯化 分别取猪粪、牛粪、鸡粪约1 g，加99mL生理盐水，室温下150 r/min摇床振摇15～30min。分别在LBS培养基上划线，将划线的LBS培养基放入厌氧罐中于37℃培养48h。观察菌落生长情况，取单一菌作纯化划线培养，连续纯化3次。

1.2.2 菌种的鉴定 菌落和细菌形态的观察：经纯化的菌株，划线接种于相应的选择培养基上。把LBS培养基放入厌氧罐中37℃培养48 h，观察菌落的情况。取单一菌落制涂片进行革兰氏染色，镜检菌体形态特征。

生理生化鉴定：将纯化的菌株接种于自制的微量发酵管及七叶苷、精氨酸微量发酵管中，连续观察3 d。

1.2.3 大肠杆菌菌悬液的制备 取上述猪粪稀释液在EMB培养基上划线，然后置于37℃培养箱中需氧培养24 h，观察菌落生长情况，取具有蓝紫色金属光泽的单一菌落作纯化划线培养，连续纯化3次，并作革兰氏染色，镜检菌体形态特征是否符合大肠杆菌的特征。将菌落特征和镜检结果明确并纯化的大肠杆菌接种于50mL营养肉汤中，置于37℃摇床（150 r/min）培养24 h，然后对大肠杆菌培养液稀释100倍。

1.2.4 生物拮抗试验 将鉴定的菌株接种于50mL营养肉汤，乳酸杆菌放入厌氧罐中37℃培养48h。取0.1mL稀释好的大肠杆菌菌液到营养琼脂平板，用灭菌冷却的三角棒涂布均匀，干燥15～30min。放置灭菌冷却的牛津杯，每个平板放3个，一次到位。用吸管分别吸取乳酸杆菌上清液（3000 r/min，20min）以及乳酸杆菌全菌液，加满牛津杯。置37℃温箱中培养24h，观察抑菌圈大小，并用游标卡尺测量抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 乳酸杆菌的分离纯化结果 在LBS划线培养的菌株中随机挑选1株菌株，进行纯化培养，鸡粪菌株代号为LBJ、猪粪菌株代号为LBZ、牛粪菌株代号为LBN。

2.2 乳酸杆菌的鉴定结果

2.2.1 菌落特征及细菌形态特征 LBJ菌株在LBS培养基上呈乳白色、半透明、光滑、圆形的菌落。LBZ菌株和LBN菌株在LBS培养基上呈乳白色、光滑、圆形的菌落，较鸡粪中分离的菌落略大。

LBJ菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，散在；LBZ菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，较LBJ菌株略大，散在；LBN菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，单个或成双存在，菌体长。

2.2.2 生理生化鉴定结果 3次重复的微量发酵管培养结果见表1。除七叶苷、精氨酸外，接种前为灰色，接种后阳性反应为变黄，阴性为颜色不变。七叶苷接种前为淡紫色，阳性反应为黄色，阴性反应为深红色。以上微量发酵管除精氨酸外，其余都为糖、醇发酵，精氨酸发酵是为了验证有无氨气产生，接种前为绿色，阳性反应为黄色，阴性反应为紫色。

表1 微量发酵管培养结果

2.2.3 鉴定结果 根据菌落特征和细菌形态，3株菌都符合乳酸杆菌的特征。生化培养结果，查《伯杰氏手册》，LBJ属于发酵乳杆菌，LBZ属于木糖乳杆菌，LBN属于发状乳杆菌。手册中发酵乳杆菌在甘露糖项为弱反应，实际观察结果为阳性；木糖乳杆菌在乳糖项为株间不同，实际观察结果为阳性；发状乳杆菌在鼠李糖、山梨醇项未作试验，实际结果为阳性。

2.3 生物拮抗试验结果 在生物拮抗试验中发现，只有从鸡粪中分离的乳酸杆菌（LBJ）对分离的大肠杆菌有拮抗作用，而从牛粪、猪粪中分离的乳酸杆菌没有拮抗作用，具体见表2。在LBJ菌株的拮抗作用中，我们发现上清液的作用明显大于全菌液，差异显著（P<0.05）。

3 讨论与结论

3.1 乳酸杆菌的分离鉴定 孟军、刘淑英等在分离和鉴定鸡源乳酸杆菌时所用的方法是将增菌培养后的菌液在培养基上作划线分离培养，从中选取各个形态不同的菌落，再进行划线分离和纯化培养，最后得到多种乳酸杆菌菌株。刘立恒在乳酸杆菌分离前进行了耐酸筛选和耐胆盐筛选，这样可以保证筛选出的菌株在肠道定植的可能性。本试验在对牛粪、鸡粪、猪粪的乳酸杆菌分离纯化中，每个样品随机传代并纯化一个生长迅速的菌落，得到牛、鸡、猪乳酸杆菌菌株各1株，再对其进行形态和生化鉴定。

表2 生物拮抗试验结果（抑菌圈直径：mm）

3.2 生物拮抗作用 本试验结果表明，来自牛、猪、鸡的 3株乳酸杆菌（LBN、LBZ、LBJ）对猪源大肠杆菌有不同的作用。LBJ菌株对猪源大肠杆菌有拮抗作用，其余两株没有。而LBJ乳酸杆菌的培养上清液和全菌液对猪源大肠杆菌的拮抗作用效果亦不同。上清液的生物拮抗作用大于全菌液的生物拮抗作用，分析原因可能有：（1）就代谢产物来说，上清液纯度、浓度大于全菌液；（2）由于分离了菌体，有可能黏度减小，扩散能力增强；（3）由于在生物拮抗试验中没有将培养基放在厌氧罐中，而乳酸杆菌为兼性厌氧菌，在氧浓度相对较高的条件下没有产生乳酸，从而使试验结果受到影响；（4）在使用牛津杯的过程中，有可能菌体沉淀集聚在牛津杯的底部边缘生长，从而影响了代谢产物的渗透作用。

3.3 结论 此次试验分别从鸡粪、牛粪、猪粪中分离纯化出发酵乳杆菌、发状乳杆菌、木糖乳杆菌；体外生物拮抗试验的结果是鸡源发酵乳杆菌对猪源大肠杆菌有拮抗作用，而牛源发状乳杆菌和猪源木糖乳杆菌对大肠杆菌没有拮抗作用，且鸡源发酵乳杆菌的上清液对大肠杆菌的拮抗作用大于全菌液。

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