慢性脑缺血大鼠OXR表达的实验分析

吕 斌 娄季宇 张 萍 李文杰

1）河南省食品药品检验所 郑州 450003 2）郑州大学第二附属医院 郑州 4500143）郑州市第一人民医院 郑州450002 3）郑州大学公共卫生学院 郑州 450001

本文通过结扎双侧的颈总动脉法，建立慢性脑缺血大鼠模型，观察大鼠脑组织OX1R、OX2R的表达及其随时间变化的情况，探讨其引起改变的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 SPF级SD大鼠月龄12～14个月，体质量300～350g，雄雌不限，由郑州大学医学院实验动物中心提供。山羊抗多克隆OX1R抗体、OX2R抗体500μg／mL，购自Santa Cruz公司，SP免疫组化试剂盒（山羊）购自北京中山生物试剂公司。其他试剂为进口分装优级纯。

1.2 慢性脑脑缺血大鼠模型建立及实验分组 参照Ohta等［1］方法制作慢性脑缺血大鼠模型。大鼠术前12h禁食，4 h禁水。用1%戊巴比妥钠（10mg／kg）腹腔进行注射麻醉，保证在手术期间有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后，沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线给与结扎，术中大鼠肛温保持在36.5℃～37.5℃，手术后动物送至有通风和空调设备的动物房饲养。实验动物随机分为正常组、假手术组、模型组，正常组不予处理常规饲养，假手术组动物仅行颈前切开，不结扎颈总动脉，模型组又分为15d、1个月、2个月共3个亚组，均在相同的时间点处死。每组各12只。

1.3 大鼠的学习记忆能力测试结果 采用水迷宫法，进行大鼠记忆功能的测定。各组大鼠手术前先进行训练。正式训练前先将大鼠放在安全台的附近，让其自行游上安全台2次，然后再分别从中间点、起点各让其自由游上安全台，进行预训练，去除灵活性过差的大鼠，对其余大鼠进行正式训练，直到大鼠连续3次从起点到达终点，游迷宫所需时间差＜10 s，错误次数＜1次，即为训练成功。对已经过训练的大鼠，分别于术后不同时间点再次游迷宫，衡量该大鼠记忆功能，以大鼠自迷宫起点至安全台终点所需时间（即逃避潜伏期）为衡量记忆功能的指标，连测10次，取其平均值。

1.4 脑组织切片制备和脑组织OXR表达测定、OX1R双标免疫荧光测定 各组动物达到规定的时间点时，采用10%水合氯醛麻醉（3～5mL／kg），用20mL的注射器接穿刺针，小心插入左心室，同时剪开右心耳，注入灭菌过的温生理盐水，直至流出的液体变清后，再灌注4%多聚甲醛0.1mol／L PBS（pH 7.2）约60mL，再断头取脑，之后，置4%多聚甲醛0.1mol／L PBS固定液，浸泡8h，作常规固定、石蜡包埋，连续冠状切片，片厚为2μm。取2张连续切片，分别用于OX1R、OX2R抗体进行免疫组化染色。应用SP染色试剂盒，进行免疫组化染色，操作步骤参照试剂盒说明书进行。一抗浓度为分别为1∶200、1∶100，4℃过夜；滴加生物素化二抗，37℃孵育20min；滴加试剂SP，37℃孵育20min，DAB显色，镜下控制时间，光镜观察，镜下计数。采用盲法计数，OX1R主要表达于CA1区，OX2R主要表达于CA3区［5］，OX1R每张切片的皮层、海马CA1区，OX2R每张切片的皮层、海马CA3区计数5个视野1000个细胞，数出阳性细胞数。

双标免疫荧光测定取15d模型组部分切片，严格按照双标免疫荧光步骤对OX1R抗体进行双标免疫荧光测定，在激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS，FV300）下观察OX1R的表达。

2 结果

2.1 行为学评价 结果表明，假手术组的逃避潜伏期［（38.146±13.232）s］与正常组［（32.427±19.206）s］比较，差异无统计学意义（P＞0.05），且与其他各组比较的统计学差异结果均一致。模型组15d逃避潜伏期（96.502±25.571）s，较正常组显著延长（P＜0.01），说明缺血15d时大鼠的学习记忆能力有明显减退。模型组1个月逃避潜伏期［（74.607±26.543）s、2个月（67.834±27.350）s］与模型组15d比较有统计学意义（P＜0.01）。说明随着距离缺血时间点远离，大鼠的学习记忆能力较15d模型有所好转；与正常组进行比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；模型组2个月逃避潜伏期与模型组1个月比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明模型组仍未能达到正常组水平；模型组2个月较1个月学习记忆能力进一步好转。

2.2 OX1R、OX2R的表达 见表1。结果显示：模型组15d时的OX1R的表达与正常组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；15d后明显下降，1个月时与正常组无统计学差异；2个月时与模型组15d差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 皮层、海马CA1区OX1R及皮层、海马CA3区OX2R阳性表达的细胞数

2.3 各组大鼠海马周围神经纤维OX2R表达的平均灰度值比较 见表2。15d时神经纤维的着色与正常组相比差异有统计学意义。（P＜0.01）；1个月时与15d时比较差异有统计学意义（P＜0.01），与正常组比无统计学差异；2个月时与1个月比较差异无统计学意义，与模型组15d比较差异有统计学（P＜0.01）。

表2 各组大鼠海马周围神经纤维OX2R表达的平均灰度值比较

2.4 模型组15d时海马CA1区，OX1R的双标免疫荧光 见图1～图3。NSE是标记神经元特异性抗体，由此证明OX1R确实可以表达于神经元。

图1 一抗为山羊抗大鼠OX1R抗体，二抗兔抗山羊CY3标记的荧光图片（红色）

图2 一抗为小鼠抗大鼠NSE抗体，二抗为羊抗小鼠FITC标记的荧光图片（绿色）

图3 激光共聚焦显微镜下的双标图片（黄色）

3 讨论

Orexin及其受体的生理功能与摄食、调节营养与能量平衡、睡眠觉醒周期、神经内分泌及行为等多方面因素有关［3］。Irving等的研究发现，急性大鼠脑缺血时OX1R表达会增高［2］。本研究采用免疫组化法，观察慢性缺血性脑损伤，发现OXR表达会随缺血时间的改变而变化，表明orexin系统与慢性缺血性脑损伤的相关病理过程有关，具体机制有待进一步研究。

脑组织缺血早期，机体各种因素首先刺激下丘脑Orexin释放表达，进而促进NPY、皮质激素释放因子、ACTH的升高，导致糖皮质激素、肾上腺素增加，体内自主神经系统过度活化。然而大量的CRH、糖皮质激素和NPY会对下丘脑Orexin产生强烈的抑制作用，加上自由基的破坏作用，最终使Orexin表达能力下降。因此，会从脑缺血的急性期持续到15dOXR表达的增高。缺血15d后，免疫和应激反应减弱，CRF、糖皮质激素、自由基和NPY水平会下降，Orexin表达能力开始上升，恢复新的平衡［4］。OXR表达下降，在1m时较15d时明显下降。在脑缺血的后期，机体会促进修复下丘脑OXR的表达，因此缺血1个月后OXR逐渐增多，脑缺血2m时明显升高。

从组织学角度看，脑缺血15d时部分神经细胞将萎缩、缺血1m时大部分神经细胞体积有缩小现象、胞核浓缩、深染、结构不清。在脑缺血2个月时部分细胞形态基本恢复正常。从信号传导角度分析，Orexin系统在慢性缺血性脑损伤的病理过程中，起到双向调控的作用。脑缺血的早期Orexin与OXR结合后，通过Gq信号途径与磷脂酶C（PLC）产生偶联，能激活细胞膜上的PLC，进而催化质膜磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）的水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。细胞内Ca2＋超载，钙蛋白酶被过度激活，引起其底物蛋白的过度降解，使细胞周期停止在G2期，导致细胞损伤或凋亡［5］。脑缺血后期OXR激活了Gs的信号途经，激活cAMP依赖的蛋白激酶，使cAMP含量升高，促进下游基因产物如脑源性神经生长因子、Bcl－2、c－Fos等的表达，促进缺血后神经细胞的存活和再生［6］。

OX1R在脑内分布很广泛，大鼠的海马、皮层、下丘脑等部位均能OX1R表达，而OX1R主要表达于神经细胞的胞浆和胞膜，部分胶质细胞内也有OX1R表达。胶质细胞能为神经细胞的再生提供充足的营养，提示胶质细胞的OX1R表达可能会有神经保护作用。NSE是特异标记神经元的抗体，本研究通过双标免疫荧光证实OX1R的确在神经元有表达，与已往研究相一致。

本研究还发现，OX2R除表达于上述部位神经元外，在皮层的深层也有表达，而OX1R没有这种表达，这在以前的研究中未曾见过报道。原位杂交结果表明OX1R和OX2R mRNA的分布有显著差异，其原因可能为OX2R在皮层的表达主要在皮质的深层，而神经纤维主要集中在皮质的深层，所以OX2R有较强的神经纤维着色。

OXR在慢性脑缺血的表达及其变化揭示了脑神经细胞损伤、修复的整个变化过程。脑缺血时细胞形态的变化及记忆能力明显下降，均支持OXR与神经细胞的凋亡有一定关系，与Voisin等［7］的研究结果相符。而缺血2月时部分细胞形态的恢复，及2月时大鼠的学习记忆能力的明显好转，可能与OX2R介导的细胞保护作用有关，与Katsuki等［8］的研究结果一致。因此OXR在慢性脑缺血中起双向调节作用，其具体机制有待进一步研究。

［1］OhtaH.NishikawaH.KimuraH，et al.Chronic cerebral hypoperfusion by permanent internal carotid ligation produces learning impairment without brain damage in rats［J］.Neuroscience，1997，79（4）：1039－1050.

［2］Irving EA，Harrison DC，Babbs AJ，et al.Increased cortical expression of the orexin－1receptor following permanent middle cerebral artery occlusion in the rat［J］.Neurosci Lett，2002，324：53－56.

［3］Smart D，Jerman J.The physiology and pharmacology of the orexins［J］.Pharmacol Ther，2002，94：51－61.

［4］Taylor MM，Samson WK.The other side of the Orexins：endocrine and metabolic actions［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，284：E13－17.

［5］Ray SK，Fidan M，Nowak MW，et al.Oxidativestressand Ca2＋influx and upregulate calpain and induce apoptosis in PC12cells［J］.Brain Res，2000，852：326－334.

［6］Neves SR，Ram PT，Iyengar R.G Protein pathways［J］.Science，2002，296：1636－1639.

［7］Voisin T，El Firar，Avondo V，et al.Orexin－induced apoptosis：the key role of the seven transmembran domain orexin type2 receptor［J］.Endocrinology，2006，7：1－32.

［8］Katsuki，Hiroshi，Akaike，et al.Quinolinic acid toxicity on orexin neurons blocked by gamma aminobutyric acid type A receptor stimulation［J］.Lippincott Williams ＆ Wilkins，Inc，2005，16（11）：1157－1161 .