生物添加剂对水葫芦与甜玉米秸秆混合青贮品质的影响

陈鑫珠，庄益芬，张建国，廖惠珍，张文昌，张兆阳，陈庆达

（1.华南农业大学农学院，广东 广州510642；2.福建农林大学动物科学学院，福建 福州350002）

水葫芦（Eichhorniacrassipes），别名凤眼莲、洋水仙等，是单子叶植物，为雨久花科、凤眼莲属多年生漂浮性水生草本植物。1901年作为花卉引入我国，由于水葫芦无性与有性繁殖力均强，喜群生，往往形成单一的优势群落，从而导致了以水葫芦为主体的有害水草的“疯长”，堵塞了河道，对社会、经济也产生了严重的负面影响，现被“世界自然保护联盟”列为世界百名“生物杀手榜”的亚军和世界公认的十大害草之冠。由此，控制水葫芦蔓延倍受重视。

目前水葫芦的转化利用方式主要有3种：第1种，用作能源；第2种，用作食用菌类的培养原料；第3种，作为高产的青绿饲料。Gajalakshmi等［1］研究表明，利用水葫芦的堆肥和蠕虫蠕动堆肥生产的绿肥，对某些植物的生长有明显的促进效果，而且安全可行。杨宣华等［2］利用35%水葫芦代替常规培养料中棉籽壳栽培平菇，生物学效率达161%，获得较好的经济效益。我国曾开展利用水葫芦栽培平菇、金针菇、草菇等多种食用菌［3］。利用经过发酵处理后的水葫芦进行喂养鱼试验，也取得了良好的效果［4］。

水葫芦的营养丰富，素来有“经典饲料”之称，其鲜草的营养成分为粗蛋白1.2%，粗脂肪0.2%，粗纤维1.1%，无氮浸出物2.3%，粗灰分1.3%［5］。以单位面积产量计算，水葫芦生产的蛋白质比大豆还高6～10倍，将水葫芦加工后掺入牛饲料中，其所含的蛋白质和无机成分可与棉籽粉和大豆粉相媲美，是营养丰富而全面的优质饲料。水葫芦为水生植物，含有较高的水分，最高可达到98%以上，打捞后易变质，必须采用有效的方法处理后才能长期保存和利用。随着青贮饲料技术的研究和推广，调制水葫芦青贮不失为一种技术上可行、经济上合理的饲料化利用的有效途径。采用青贮发酵的方法不仅可使水葫芦长期保存和利用，又可保持水葫芦原有的多汁、适口以及青贮饲料的诸多优良特性。目前，有关水葫芦青贮的研究较少，技术方法还有待于进一步提高。因此，借鉴国外的一些先进技术，研究探索有效利用水葫芦的方法对于我国青贮饲料的多元化发展，缓解目前常规饲料资源紧缺具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 青贮原料

青贮原料为水葫芦和甜玉米（Zeamaysvar.rugosa）秸秆，水葫芦是福建农林大学校园湖水中生长的，玉米秸秆是福建农林大学作物学院实验基地种植的世珍甜玉米秸秆，2种原料均于2009年6月29日人工刈割，晾晒24h后调制青贮。

1.2 添加剂

添加剂为绿汁发酵液（fermented green juice，FGJ）、纤维素酶（cellulase，CEL）、绿汁发酵液＋纤维素酶（MIX）3种。

FGJ参照文献［6］的方法制成。CEL为广东溢多利公司提供纯度为98%的纤维素酶，酶活为10万U／g。将其配制成2.5%水溶液备用。

1.3 试验设计

设4×4的两因子试验。即4种混合比例和4个添加剂处理。4种混合比例青贮按水葫芦∶玉米秸秆晾晒后的鲜重比为8∶2，7∶3，6∶4，5∶5分别进行调制（分别用 W8M2、W7M3、W6M4、W5M5表示）。4个添加剂处理是无添加（CK）、添加2mL／kg绿汁发酵液（FGJ）、添加2mL／kg纤维素酶（CEL）和添加2mL／kg绿汁发酵液＋2mL／kg纤维素酶（MIX）。每个处理设3次重复。

1.4 青贮调制

2009年6月30日进行青贮调制。2种原料切短成1～2cm长、分别混合均匀，将2种原料按试验设计比例分别称重，将2种原料混合均匀后，按每个重复所需重量（预试验测得）分别称重装入贴有标签的塑料袋内，加入添加剂和蒸馏水（所加液体体积相等），混匀后装入1L专用青贮试验塑料瓶内，填装、压实、密封。常温条件下贮存60d开封，供分析测定。

1.5 测定项目与方法

原料和青贮饲料的分析样本是通过在65℃、48h烘干测初水分；按常规方法［7］测定水分和粗蛋白质（crude protein，CP）含量；中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量用 Van Soent等［8］的方法测定；水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）用比色法［9］测定。取具代表性青贮样品100g装入有刻度的500mL的广口锥形瓶中，加入蒸馏水定容至500mL，放置4℃冰箱中，18h后用滤纸过滤，制备青贮浸提液，用pH计测定浸提液的pH值［10］；用岛津LC－20AT型高效液相色谱分析浸提液的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。色谱柱：Shodex Rspak KC－811S－DVB gel Column 300×8mm；检测器：SPDM10AVp；流动相：3mmol／L 高氯酸［11］；采用苯酚－次氯酸钠比色法测定氨态氮含量［12］；半纤维素（hemi－cellulose，HC）和干物质回收率（dry matter recovery，DMR）由计算得出，计算公式如下：

DMR（%）＝［（开封时回收青贮料重×青贮料干物率）／（装填时装入原料重×原料干物率）］×100

1.6 青贮质量感官评定方法

青贮料开封后参考德国农业协会（DIG）青贮质量感官评分标准［13］进行感官质量鉴定。根据青贮料的气味、结构和色泽评定青贮料的优劣。

1.7 统计分析

原始数据经Excel 2003统计软件初步处理后，采用SPSS 17.0统计软件进行两因素和单因素方差分析和多重比较，结果用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 青贮原料的化学成分

水葫芦的水分、CP、NDF、ADF和HC均高于甜玉米秸秆（表1）。甜玉米秸秆的WSC是水葫芦的8.3倍。

2.2 青贮质量感官评定

青贮开封后进行感官评定。各组青贮料的茎叶结构基本保存完好，均未见发霉现象；颜色与原料原色相近；酸香味；质地松软，表明此次青贮达到良好、较为一致的厌氧条件。从各添加剂处理来看，每种混合比例青贮中，在色泽方面，CK组的颜色与原料原色相比，稍微偏黄，其他3个添加剂处理组的颜色和原料原色较相近；在气味方面，CK组的酸味较淡，CEL组的酸味较浓，稍有不舒适感，FGJ组和MIX组酸味较舒适；在质地方面，CK组稍有粘手感觉，其他3个添加剂组手感蓬松。从混合比例来看，随着混合青贮中玉米秸秆比例的升高，青贮的颜色、气味、质地更好。

表1 水葫芦和甜玉米秸秆的化学成分Table 1 Chemical composition of water hyacinth and maize straw

2.3 青贮的化学成分

混合比例和添加剂对5个项目均有显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）影响，且混合比例和添加剂之间在WSC、NDF、ADF和 HC这4个项目上有显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）的交互作用（表2）。

表2 混合比例和添加剂对青贮化学成分的影响Table 2 Effects of mixed ratios and additives on chemical composition of silages

同添加剂处理中不同混合比例之间相互比较，CK、FGJ、CEL以及MIX处理呈大致相同的变化趋势，随玉米秸秆比例的增多，水分下降，WSC增加，NDF和ADF减少。特别是这4个添加剂处理中W5M5的WSC和ADF分别显著高于和显著低于其他3种混合比例（P＜0.05）。此外，CK处理中，W7M3的WSC显著（P＜0.05）高于W8M2；W6M4的水分显著低于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的 HC显著高于 W6M4（P＜0.05）。FGJ处理中，W7M3的水分显著低于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的水分显著低于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的NDF显著低于W6M4，HC显著高于W6M4（P＜0.05）。CEL处理中，W7M3的水分显著低于 W8M2，WSC显著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4水分和 HC显著低于 W7M3，ADF显著高于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的NDF显著低于W6M4（P＜0.05）。MIX处理中，W7M3的水分和 ADF显著低于 W8M2、HC显著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的水分以及NDF和HC显著低于W7M3、WSC显著高于 W7M3（P＜0.05）。

同混合比例中不同添加剂处理之间相互比较，4种混合比例中，均以CK处理的WSC最低、NDF和HC最高。并且，在NDF和HC上，CK处理与其他3个添加剂处理间有显著差异（W7M3中CEL处理的HC除外，P＜0.05）。此外，W8M2中，MIX处理的 WSC显著高于CK（P＜0.05）；W6M4中，MIX处理的水分显著低于CK、WSC显著高于CK（P＜0.05）；W5M5中，3个添加剂处理的 WSC均显著高于CK、FGJ处理的水分显著低于CK（P＜0.05）。特别是，在 W8M2中，MIX处理的WSC显著高于FGJ和CEL处理、NDF和HC显著低于FGJ和CEL处理（P＜0.05）；在 W6M4中，MIX处理的NDF显著低于FGJ和CEL处理（P＜0.05）；在 W5M5中，MIX处理的WSC显著高于FGJ和CEL处理（P＜0.05）。

可见，4种添加剂处理的化学品质随玉米秸秆比例的增加有所提高；在4种混合比例青贮中，3种添加剂均显著改善了青贮的化学品质，在W8M2和W5M5中MIX的添加效果优于FGJ及CEL。

2.4 青贮的发酵品质

混合比例和添加剂对pH、LA、DMR和NH3－N有显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）影响（表3），混合比例和添加剂之间有显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）的交互作用。另外，混合比例对BA有极显著（P＜0.01）的影响。

表3 混合比例和添加剂对青贮发酵品质的影响Table 3 Effects of mixed ratio and additives on fermentation quality of silages

同添加剂处理中不同混合比例之间相互比较，CK、FGJ、CEL以及MIX处理中，均以W8M2的pH、BA和NH3－N最高，LA和DMR最低。特别是，W8M2的pH均远超过4.2，且BA的生成量较多。然而，随混合青贮中玉米秸秆比例的增多，pH显著下降（MIX处理中 W5M5除外，P＜0.05），在 W7M3、W6M4和 W5M5中未检测到或检测到微量的BA，并与W8M2之间均有显著差异（P＜0.05）。此外，CK处理中，W7M3的LA显著高于W8M2，AA和PA显著低于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的LA和 DMR显著高于 W7M3，NH3－N显著低于W7M3（P＜0.05）；W5M5的 NH3－N 显著低于 W6M4（P＜0.05）。FGJ处理中，W7M3的 DMR显著高于W8M2，NH3－N显著低于 W8M2（P＜0.05）；W5M5的LA和DMR显著高于 W6M4，NH3－N显著低于 W6M4（P＜0.05）。CEL处理中，W7M3的DMR显著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的LA显著高于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的LA显著高于 W6M4，NH3－N显著低于 W6M4（P＜0.05）。MIX处理中，W7M3的LA和DMR显著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的NH3－N显著低于 W7M3（P＜0.05）；W6M4和 W5M5在所有指标上均无显著差异。

同混合比例中不同添加剂处理之间相互比较，4种混合比例中，均以CK处理的pH和NH3－N最高、DMR最低。并且，CK处理与其他3个添加剂处理间差异显著（W5M5的NH3－N除外，P＜0.05）。此外，W8M2中，其他3个添加剂处理的LA均显著高于CK，FGJ和MIX处理的AA和BA显著低于CK，FGJ处理的PA显著低于CK（P＜0.05）；W7M3中，MIX处理的LA显著高于CK，CEL处理的PA显著高于CK（P＜0.05）；W5M5中，FGJ和CEL处理的LA显著高于CK（P＜0.05）。在W8M2、W7M3以及 W6M4中，MIX处理的pH均低于FGJ和CEL处理（P＜0.05），在 W6M4中，MIX处理的NH3－N也低于FGJ及CEL处理（P＜0.05）。

可见，W8M2中所有青贮的发酵品质不良；4种添加剂处理的发酵品质随玉米秸秆比例的增加而提高，但MIX处理中，玉米秸秆的比例达到40%以后，再增加玉米秸秆已无效；在4种混合比例青贮中，3种添加剂均有显著的添加效果，在W8M2、W7M3以及W6M4中，MIX的添加效果优于FGJ及CEL。

3 讨论

3.1 混合比例对青贮品质的影响

庄益芬等［14］调查了绿汁发酵液和纤维素酶对2种不同含水率（高：70.58%，低：39.62%）的水葫芦青贮品质的影响，结果发现，青贮料的pH均在4.2以上，且70.58%含水率的青贮料pH值低于39.62%含水率的青贮料，原因可能是水葫芦的碳水化合物不足，同时，水分过低抑制乳酸菌的活动。本试验利用甜玉米秸秆与水葫芦混合，旨在提高原料的可溶性碳水化合物含量。W8M2中4种添加处理的pH值均较高（4.90～5.56），且产生较多BA，认为这是原料 WSC（5.63%）不足所致。随着玉米秸秆比例的升高，混合原料的 WSC分别达到7.30%，8.97%和10.64%，青贮料的pH显著下降（MIX处理中W5M5除外），在 W7M3、W6M4和W5M5中未检测到或只检测到微量的BA，青贮品质显著提高。这与其他一些研究结果相似［15－18］，张英俊等［19］研究葛藤（Pueraria lobata）玉米混合青贮结果表明，混合青贮和玉米单贮pH值分别为3.76和3.66，葛藤单贮为4.6。葛藤一般不能用常规方法单独青贮，原因是葛藤含糖量低，不能保证青贮过程中乳酸菌发酵占绝对优势。田晋梅和谢海军［20］研究不同比例披碱草（Elymusdahuricus）和苜蓿（Medicagosativa）混合青贮，证实披碱草和苜蓿7∶3比例混合，pH值比其他比例混合青贮料低，挥发性碱基氮的含量也比其他组低。王昆昆等［21］也获得相似结果。pH值是反映青贮品质优劣的重要指标，pH值低，证明乳酸菌在发酵过程中占主导，产生有机酸的含量高，有效抑制不良微生物的发酵，青贮发酵品质较好。本试验4个添加剂处理中，W6M4和 W5M5的pH均下降至4.2以下，特别是W5M5的pH、NH3－N和NDF最低，WSC最高。说明在水葫芦玉米秸秆混合青贮中，玉米秸秆的比例越高，越有利于青贮的乳酸发酵。

3.2 添加剂对青贮品质的影响

绿汁发酵液是新型的青贮添加剂，其由纯自然微生物群落组成，作为青贮的生物添加剂是一项新的尝试，最初由日本开始研究。其取材方便，制作简单，能够有效改善青贮的发酵品质，目前被认为是最好的天然生物添加剂［22－24］。本试验添加FGJ使4种混合比例青贮料的pH、NDF和HC显著降低，DMR显著提高，并使 W8M2和W5M5的LA显著增加，W5M5除外的青贮料的NH3－N显著降低。这与马春晖等［25］的研究结果相似。Shao等［26］在燕麦（Avenasativa）中分别添加葡萄糖、山梨酸及绿汁发酵液调制青贮，对比发现，添加绿汁发酵液可获得最低的pH值，最高的乳酸含量以及较高的WSC残留量。Bureenok等［27］在大黍（Panicummaximum）青贮中添加绿汁发酵液后，pH值及氨态氮含量显著降低，乳酸含量显著升高，明显改善了青贮的发酵品质。Ohshima等［28－30］研究表明，20℃条件下添加绿汁发酵液和接种乳酸菌均可有效地改善苜蓿青贮的发酵品质，但30℃条件下乳酸菌处理作用效果不明显，而绿汁发酵液仍可显著改善发酵品质，其主要原因在于乳酸菌制剂中仅含有特定的乳酸菌菌种，而绿汁发酵液中存在适合原料发酵的多种乳酸菌菌种，因此，绿汁发酵液能够在比较广的青贮环境条件下发挥其促进乳酸发酵的作用。许庆芳等［31］报道，与对照组相比，添加绿汁发酵液可显著降低苜蓿青贮的pH值和丁酸含量，减少非蛋白氮含量，增加乳酸含量。庄益芬等［32］研究表明，绿汁发酵液组的pH值、氨态氮和气体损失率都极显著降低，而干物质回收率显著升高。因为绿汁发酵液能在青贮发酵初期显著提高乳酸菌基数，使乳酸菌旺盛繁殖，产生大量乳酸，迅速降低青贮的pH值，有效抑制不良微生物的活动，并减少干物质损失。

纤维素酶作为青贮添加剂的应用，越来越受到人们的关注。纤维素酶能够降解青贮原料中的结构性碳水化合物为单糖或双糖，为乳酸菌的发酵提供更多可利用的底物，并减少干物质的损失［33］。本试验添加CEL处理的青贮料，pH和NDF均显著低于对照，DMR显著高于对照，青贮料的NH3－N含量显著降低（W5M5除外）。Dewar等［34］研究多年生黑麦草（Loliumperenne）、意大利黑麦草和鸭茅（Dactylisglomerata）的半纤维素酶类时，发现经过7d处理的多年生黑麦草半纤维素每kg基底物质最高可产生228g的糖，分析产出的糖类表明这些主要是木糖和阿拉伯糖，这2种糖都是可溶性的，也就是说都是乳酸菌可以利用来发酵的底物。纤维素酶可有效解决青贮发酵底物不足和纤维含量过高的问题，并且抑制氨的产生，提高青贮饲料的发酵品质［35］。本试验添加CEL，显著提高了W5M5的WSC，而对其他混合比例青贮的WSC有所升高但无显著差异。原因可能为：1）水葫芦原料的WSC含量低，仅为2.29%，混合青贮中玉米秸秆比例越低，发酵底物WSC越缺乏，纤维素酶降解结构性碳水化合物产生的WSC被乳酸菌利用的量越多，青贮料中剩余量则较少；2）纤维素酶在青贮中的效果不一致［36－40］。李静等［36］报道添加纤维素酶有改善稻草青贮料发酵品质和饲用价值的作用。Sheperd和Kung［37］添加纤维素酶于玉米青贮中，发现不同剂量的酶对发酵过程中酸的产生均无影响；Kung等［38］在苜蓿半干青贮中添加细胞壁降解酶，没有明显提高青贮发酵。植物细胞壁是由纤维素搭成主干骨架，其中填充有大量半纤维素、果胶和木质素等，这些物质相互交融混合构成了极其复杂的结构体系。该结构体系的复杂程度和抗降解性依植物种类、部位及成熟程度等的不同而异。故常有纤维素酶难以将细胞壁彻底裂解、添加无效的现象。纤维素酶是一种微生物制剂，对温度、湿度、酸、碱等敏感，故青贮原料理化特性的不同也是导致使用效果不一致的因素。

许多研究结果表明［39，40］，绿汁发酵液与纤维素酶共同作用的效果明显优于单独使用，具有相乘效果。这是因为绿汁发酵液的添加弥补了青贮原料中乳酸菌数量的不足，加快了乳酸发酵的启动，纤维素酶能够降解青贮原料中的结构性碳水化合物为单糖或双糖，为乳酸菌的发酵提供更多可利用的底物，二者协同作用，可在较短时间内使乳酸菌迅速繁殖，产生大量乳酸，快速降低pH，有效抑制其他菌群的活动。pH值的快速降低还有助于抑制植物酶的活性，抑制蛋白质降解成氨态氮，减少蛋白质损失。

4 结论

甜玉米秸秆混合比例越高，青贮效果越好；添加绿汁发酵液和纤维素均能提高青贮的发酵品质，绿汁发酵液和纤维素酶同时添加具有相乘作用。另外，添加剂的使用，不仅能够有效提高混合青贮的发酵品质，还能降低可调制优质水葫芦玉米秸秆混合青贮中玉米秸秆的比例。这对于玉米种植量少，而水葫芦颇多的南方地区来说具有重要意义。

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