胃癌前病变癌基因与浊毒的相关性研究*

河北省中医院 郭喜军 鄂 辉 张颜伟(石家庄050011)

李佃贵教授创立的“浊毒理论”为胃癌前病变的中医药治疗提供了新的治疗思路，本实验采用高糖加辛辣刺激饮食建立浊毒内蕴证动物模型，继以MNNG溶液自由饮用，雷尼替丁灌胃，从而制造胃癌前病变浊毒内蕴证大鼠模型，检测相关癌基因指标探讨与浊毒之间的联系，为浊毒证临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:清洁级健康雄性Wistar大鼠30只，5周龄，体质量140 g±10 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，动物合格证编号:2004－0007。

1.1.2 试剂:甲硝基亚硝基胍 (MNNG):购自于日本东京，由石家庄勃盛化学试剂有限公司提供。盐酸雷尼替丁胶囊:0.15 g/粒，中诺药业 (石家庄)有限公司。即用型Bcl－2、c－erbB－2、c－myc免疫组化染色试剂盒，DAB显色剂，购自北京中山生物技术有限公司。

1.1.3 实验设备:酶联免疫检测仪:MK3，芬兰雷勃;超低温保存箱:MDF－382E，日本三洋;全自动洗板机:8×12，美国;光学显微镜:CH－20，日本Olympus;电热恒温水箱:600型，天津;显微摄像全自动图像分析仪:HPIAS1000型，同济千屏影像公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模:30只Wistar大鼠随机分为3组，即正常组 (A组)、湿热证胃癌前病变组 (B组)和模拟浊毒内蕴胃癌前病变组 (C组)，各组动物适应性喂养1周后用于实验。正常组普通喂养。造模组大鼠自第2周开始每日自由饮用200μg/m L的MNNG(塑料瓶用黑色塑料袋严密包裹避光)，并且采用0.03 g/mL的雷尼替丁溶液灌胃，造模组每只大鼠灌胃1 mL;造模组在普通饲料喂养的同时在饲料中混合以适量的蜂蜜和辣椒油，上述造模共持续8周。造模8周后从对照组、湿热模型组与模拟浊毒证组各随机抽取2只大鼠杀检，病理学检查符合胃癌前病变病理诊断标准［1］说明造模成功。造模成功后，湿热组给予自由饮水，普通饮食2周。模拟浊毒组大鼠继续给予高糖加辛辣刺激食物喂养2周。

1.2.2 标本采集与处理:湿热组与正常组大鼠禁食不禁水24 h，经断头处死后，暴露并游离其胃部，距贲门和幽门1.5 cm处离断取出全胃，沿胃大弯侧剪开，并用生理盐水冲洗后从胃窦部取材，4%多聚甲醛固定。模拟浊毒组标本采集同以上两组。后经光镜切片制作与3种癌基因免疫组化染色。

1.2.3 一般观察指标:观察各组大鼠的精神状态、体质量、大便、饮食情况及大鼠的毛色，并对大鼠的肛温情况进行观察。

1.2.4 免疫组化染色结果判断:实验步骤按试剂盒说明书进行。判断标准:bcl－2以细胞核出现棕黄色颗粒的细胞为阳性;c－myc以细胞质染色出现棕黄色颗粒的细胞为阳性;c－erbB－2以细胞膜和细胞质染色出现棕黄色颗粒的细胞为阳性。按阳性细胞百分比法:阳性细胞数＞25%为阳性。

2 结果

2.1 一般状态 正常组大鼠反应敏捷，毛色光泽，形体较肥胖，饮食量较其他各组大，大便呈颗粒状，质可。湿热组大鼠形体消瘦，皮毛见松散，精神不振，食量较正常组减少，反应较迟钝，大便气味臭秽，质多偏黏或干稀不调。浊毒内蕴组大鼠皮毛见松散枯槁，食量明显减少，眼神涣散，形体枯瘦，反应迟钝，大便质黏或干稀不调。

2.2 3组大鼠肛温变化比较 结果见表1。

2.3 3组大鼠Bcl－2、c－erbB－2、c－myc 3种癌基因的阳性表达率比较 结果见表2。

表1 3组肛门温度比较(℃，n=8，±s)

表1 3组肛门温度比较(℃，n=8，±s)

组别7 d 60 d 75 d A组 37.20±0.16 37.14±0.11 37.22±0.13 B组 37.18±0.12* 38.22±0.19＊＊ 38.35±0.20＊＊C组 37.16±0.17* 38.17±0.23＊＊ 39.10±0.15＊＊#

注:与A组比较，*P＞0.05，＊＊P＜0.05;与B组比较，#P＜0.05

表2 3组Bcl－2、cerbB－2、c－myc阳性表达率比较 (%)

3 讨论

胃癌前病变是一个病理性概念，包括肠上皮化生(IM)和异型增生 (Dys)，主要伴存于慢性萎缩性胃炎(CAG)中，是从正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段，但其本身尚不具备恶性改变。恩师李佃贵教授创立的“浊毒理论”为胃癌前病变的诊治提供了新的理论依据，但目前实验研究机制并未成熟，尚缺乏有效的实验依据，因此本研究通过动物实验建立湿热证胃癌前病变的动物模型，并以中医理论“湿热日久化生浊毒”为依据，模拟浊毒证胃癌前病变模型，检测相关癌基因指标，为浊毒研究提供实验依据。

现代中医认为“浊”与湿类同，浊为阴邪，多把浊证分为尿浊、便浊、精浊等，取其重浊黏腻之意。毒，与热类同，热为毒之渐，毒为热之极，毒属阳邪。各种原因致脾胃功能失调，运化失常，导致水湿积聚，化湿成浊，浊邪内蕴，郁而不解，气机郁滞，郁久化热，热壅血瘀而成毒，浊毒内蕴而出现一系列临床症状。浊与毒性质不同，临床上多胶着缠绵，相互影响，故并称浊毒。

Bcl－2是一种新型原癌基因，定位于染色体18q21，编码26kDa的蛋白，主要分布于核膜和胞浆内质网，可阻断细胞的编程死亡而不影响细胞的增殖，是抑制细胞凋亡的重要因素，其过度表达主要通过延长细胞寿命，使异常细胞积聚而阻止凋亡的发生。［2－5］，c－myc癌基因定位于染色体8q24，有3个外显子和两个内含子组成，大量资料表明它作为细胞生长的正性调控物促进细胞的增长，驱动细胞从G0/G1期进入S期，促进肿瘤增殖并明显抑制细胞分化。［6］

c－erbB－2癌基因定位于染色体17q21，又称为HER－2基因，编码为一种跨膜酪氨酸激酶受体，即P185蛋白，属于Ⅰ型生长因子受体，在细胞内的部分有促进酪氨酸激酶活性的作用，大量研究证实这个原癌基因对于引起和维持许多人类恶性肿瘤的致癌阶段有显著意义。［7］

本实验中通过给大鼠造模，并给大鼠饮食上模拟浊毒内蕴之证来观察3种癌基因的阳性表达率。实验结果表明，Bcl－2、c－erbB－2、c－myc 3种癌基因在造模成功后免疫组化染色结果中呈阳性表达甚至是强阳性表达，此说明癌基因的阳性表达率与中医浊毒证型之间成正比例增长关系，大鼠肌体自身处于一种促进或抑制细胞凋亡的拮抗、动态逐渐失衡的状态，超出一定范围便由生理转变为病理状态。结果显示本实验造模方法符合浊毒致病机理与浊毒证表现，说明浊毒证的形成确实能引起癌基因的阳性表达率升高，浊毒的形成是导致胃癌前病变发生的一个重要致病因素。

［1］陈奇.中药药效研究思路与方法 ［M］.北京:人民卫生出版社，2005.531－533

［2］牟兆新，侯振江.Bcl－2癌基因在消化道肿瘤研究中的应用［J］.世界华人消化杂志，2005，13(10):1 216－1 218

［3］孟华，刘丽娜，吕申.胃癌及癌前病变中胃黏膜上皮细胞增生及凋亡相关基因蛋白表达［J］.世界华人消化杂志，2004，12(2):494－496

［4］Hu L，Lao SX，Tang CZ.Expression of bcl－2 oncogene ingastric precancerous lesions and its correlation with syndromes in troditional Chinese medicine ［J］.World J Gastroenterol，2005，11(21):3 293－3 296

［5］唐纯志，劳绍贤，胡玲，等.胃炎消治疗胃癌前病变对细胞凋亡及相关基因表达的影响［J］.中国中西医结合脾胃杂志，2000，8(5):263－267

［6］方兴根，徐善水.C－myc癌基因及其表达与胶质瘤［J］.Foreign Medical Sciences Section on Neurology＆Neurosurgery，2005，32(2):76

［7］石华山，李妍.c－erbB－2癌基因与 NSCLC的研究进展［J］.细胞与分子免疫学杂志，2007，23(5):482