酪氨酸自组装成肽反应的质谱裂解研究

李红利，樊军浩

(漯河职业技术学院，河南漯河462002)

氨基酸缩合成肽反应是生命起源过程中的基本单元反应，而磷试剂在这一过程中起着举足轻重的作用［1－4］，研究磷试剂辅助下氨基酸缩合成肽的反应与揭示生命起源以及生命活动中的化学机制，并从生命起源的化学特定角度阐明生命现象的本质有着重要的学术价值和理论意义。本文以L-酪氨酸(LTry)为研究对象，以无机磷试剂三氯氧磷(POCl3)为缩合试剂，利用高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)以及多级质谱(MS/MS)技术对其自组装反应体系进行了研究，考察了在磷缩合试剂作用下酪氨酸成肽的类型及质谱裂解规律。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Bruker ESQUIRE-3000高效液相色谱-电喷雾-离子阱多级质谱仪(美国Bruker公司);Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)和依利特P230高效液相色谱仪(大连依利特公司)。

三氯氧磷为天津市化学试剂一厂生产;L-酪氨酸购于华美生物工程公司;溶剂二氧六环为天津市光复精细化工研究所生产。试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱:Zorbox C18(150 mm×2.1 mm，5 μm);流动相:流动相A为0.05%三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈;梯度洗脱设置为10 min内由20%溶剂B线形增加至50%再在10 min增加至60%，再在10 min增加至80%。检测波长:254 nm;流速:0.8 ml/min;每次进样10 μL。

1.3 质谱条件

喷雾电压为4000 V，毛细管温度:300℃，喷雾气(N2):7 psi，干燥气(N2)流速为4 L/min，温度为300℃。扫描范围为15～900 m/z，Target:200 m/z。

1.4 液相色谱-质谱联用条件

正离子检测模式，喷雾电压为4000 V，毛细管温度为350℃，喷雾气(N2):20 psi;干燥气(N2):8 L/min，扫描范围:15 ～900 m/z，Target:200 m/z。

1.5 实验方法

分别取50 mmol(0.90595 g)酪氨酸与含50 mmol三氯氧磷(4.6 ml)的50 ml二氧六环(50 ml)溶液混合。每天取20 μL反应液，用180 μL水终止反应，再用流动相(30%的已睛和70%的0.05%的三氟乙酸)400 μL稀释。三氯氧磷体系反应液透明无色，取样终止反应后变混浊。过滤后取稀释的反应液10 μL在选定的色谱条件下进行液相和质谱检测。

2 结果与讨论

2.1 反应时间的影响

实验结果显示，所生成的肽的链长随着反应时间的延长逐渐加长，但到一定时间，肽链不再增长，这表明Tyr的成肽反应存在着一个反应平衡。Tyr自组装成肽的肽链长度较短，反应主要产物为二至七肽。在Tyr－POCl3的反应体系中，鉴定出了Tyr的寡肽系列二肽、三肽、四肽、五肽、六肽和七肽(对应的离子为m/z 345、m/z 508、m/z 671、m/z 834、m/z 997 和 m/z 1160，+MS;m/z 343、m/z 506、m/z 669、m/z 832、m/z 995和m/z 1158，－MS)。还检测到了磷酰化的Tyr及磷酰化的Tyr的寡肽系列，并利用离子阱多级质谱技术对其结构进行了确认。Tyr的磷酰化寡肽系列有磷酰化二肽、三肽、四肽、五肽、六肽和磷酰化七肽、(对应的离子为 m/z 425、m/z 587、m/z 751、m/z 914，+MS;m/z 1075和 m/z 1238，－MS)。另外，在 Tyr－POCl3的反应体系中只检测到Tyr的环六肽(m/z 979，+MS)。图1所示为Tyr-POCl3反应体系分别在反应4 d、7 d、13 d、16 d、19 d、22 d的质谱图，图中各分图对应的反应时间从上到下依次增加。

图1 Tyr-POCl3反应体系在不同反应时间的ESI－MS质谱图

2.2 磷试剂辅助下酪氨酸的自组装成肽反应机理

研究中，Tyr-POCl3反应体系中检测到了磷酸化的Tyr及其磷酸化的系列小肽，推测其成肽的可能途径为:经过简单的氨基酸羧酸－磷酸混酐即磷酰化氨基酸，然后另一分子的氨基酸的氨基进攻羰基碳形成酰胺键，并脱去一分子羟基二氯氧磷形成二肽，二肽的氨基再去进攻磷酰化氨基酸的羰基碳，生成三肽，以此类推;另一种可能的途径是经过氨基酸五配位磷化合物的过渡态，该过渡态具有环状磷酸－羧酸混酐键结构，使氨基酸的羧基被活化，使其易受另一分子氨基酸的氨基的亲核进攻从而形成肽键。考虑到芳香族氨基酸的侧链基团空间位阻较大，结合研究中检测到的磷酰化小肽系列，推测成肽反应中前者是主要的途径。

2.3 酪氨酸的自组装成肽质谱裂解规律

如图2所示，在Tyr-POCl3-7days体系中检测二至七肽，在质谱图中可观察到m/z=181+163n-H的Tyr系列肽的准分子离子峰，间距为163(即Tyr残基的质量数=181－18)。对肽准分子离子的-MS2及-MS3分析显示的质谱裂解途径包括:

(1)从肽准分子离子中依次去掉一个或数个氨基酸酸残基的裂解方式，如Tyr四肽(m/z 699)→Tyr三肽(m/z 508)→Tyr二肽(m/z 343)→Tyr(m/z 180)。三肽及以上的肽，这种裂解方式占优势，是Tyr肽类的特征裂解方式。

图2 POCl3-Tyr-7days反应体系的ESI-MSn分析的质谱图(肽)

图3 Tyr-Tyr的负离子模式下质谱裂解途径

正离子模式下以Tyr二肽的质谱裂解规律，如图4所示。Tyr二肽正离子(m/z 345)脱去一分子NH3碎片形成离子A(m/z 328)，A离子继续脱去一分子Tyr残基碎片形成B离子(m/z 182)，B离子在进一步脱去一分子HCOOH碎片形成C离子(m/z 136)。另外，Tyr二肽正离子(m/z 345)还能够脱去一分子HCOOH碎片形成D离子(m/z 299)，D离子再脱去一分子Tyr残基碎片形成C离子(m/z 136)。

图4 Tyr-Tyr正负离子模式下质谱裂解途径

3 结论

本文以POCl3作为辅助试剂，进行了无机磷试剂辅助下具有芳香侧链的酪氨酸的自组装成肽反应的研究，利用液相色谱-质谱联用及电喷雾多级质谱技术对反应体系进行了组分分析和结构鉴定。研究中考察了不同反应时间对酪氨酸成肽反应的影响，鉴定出酪氨酸系列寡肽和磷酰化寡肽的存在，并探讨了磷试剂辅助下酪氨酸的成肽机理，在正、负离子阱模式下分析质谱裂解规律丰富了肽化合物的质谱学研究，为芳香族肽化合物的质谱裂解规律提供了依据，可用于鉴定芳香族肽及其磷酸化肽，同时对于研究前生命化学物质多肽及蛋白质的起源有着重要的理论意义和学术价值。

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