新疆维吾尔族和汉族非综合征型感音神经性聋患者线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变分析△

亚生江·托乎提 李彦华 徐红霞 李卉 李惠武 罗永海 汪常伟 邹广华

新疆维吾尔族和汉族非综合征型感音神经性聋患者线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变分析△

亚生江·托乎提1李彦华1徐红霞2李卉3李惠武3罗永海1汪常伟1邹广华1

目的 研究新疆地区维吾尔族（简称维族）和汉族非综合征型感音神经性聋患者线粒体DNA（mtDNA）12SrRNA A1555G突变频率并比较其差异。方法 新疆地区非综合征型遗传性聋患者维族88例、汉族75例为患者组；正常人维族82例、汉族78例为正常对照组。抽取所有受检者外周静脉血，从白细胞中提取DNA，多聚酶链反应（PCR）扩增线粒体DNA目的片断，Alw26I限制性内切酶检测A1555G点突变，对阳性病例的PCR产物进行DNA测序验证。结果 正常组中未检出DNA12Sr RNA A1555G突变，患者组中检出16例mtDNA A1555G点突变，12人为汉族（16.00%，12／75），4人为维族（4.55%，4／88），汉族与维族比较差异有统计学意义（χ2＝6.001，P＝0.014）。结论 线粒体DNA12S r RNA A1555G突变是导致新疆地区非综合征型遗传性聋患者致病的主要原因之一，汉族高于维吾尔族。

非综合征型； 基因； 突变； 遗传性聋； 线粒体

据统计，有0.05%～0.10%的儿童出生时为极重度聋，同时，一半以上的先天性聋是由于遗传因素造成的［1］。遗传性聋患者中有30%为综合征型聋，70%为非综合征型聋［2］。线粒体DNA（mtDNA）12Sr RNA A1555G突变可以导致非综合征型遗传性聋，其突变的发生频率在中国不同地区、不同民族之间有很大差异［3］。本研究旨在对中国新疆地区维吾尔族和汉族非综合征型遗传性聋患者进行mtDNA 12Sr RNA A1555G突变的研究并比较其差异，为今后该地区维汉民族遗传性聋的预防和治疗提供可靠的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集新疆喀什、阿克苏、和田等部分边远、贫穷、落后地区的非综合征型遗传性聋患者163例为患者组。其中维族88例，汉族75例；男82例，女81例；年龄3～22岁，平均15.20±2.90岁。同时，选择该地区听力正常人群160例为正常对照组，其中维族82例，汉族78例；男80例，女80例，年龄3～23岁，平均15.70±3.50岁。对全部研究对象由专业人员进行纯音测听和声导抗检查，对不能配合的患者行耳声发射、听性脑干反应检查。耳聋分级［4］：轻度：20～40 dB HL；中度：41～70 d B HL；重度：71～95 dB HL；极重度：＞95 d B HL。163例耳聋患者中重度聋151例，中度聋12例。聋前有明确氨基糖苷（aminoglycoside antibiotic，Am An）类抗生素应用史者32例，其中汉族15例，维吾尔族17例，用药年龄多在半岁到2岁之间，用药原因多为感冒、发烧和腹泻，但具体用药量不详。

耳聋患者入选标准［5］：①双侧对称性的、以高频听力下降为主的感音神经性聋；②有家族史，家系中至少2人耳聋；③不伴其他任何症状。排除标准：①有与国外种族联姻家族史者；②外耳、中耳畸形；有可能导致传导性聋病史，如有急慢性中耳炎、中耳或外耳手术史，声导抗测试结果异常；③有其他明确的导致听力下降的原因（如：细菌性脑膜炎、迷路炎、累及耳蜗的颞骨骨折等）；伴有全身疾病者（如：心脏病、糖尿病等）；④有影响听力检测结果的疾病（如：智力障碍者）；⑤诊断为进行性耳聋的患者（如自身免疫性内耳病、梅毒性内耳疾病等）；⑥己经明确为综合征型聋患者（如：Waadrnebugr综合征、Usher综合征等）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集受检者外周静脉血2～4 ml，用酚／氯仿法从白细胞中提取基因组DNA（含线粒体DNA），应用1%琼脂糖进行电泳和分光光度计进行纯度和浓度鉴定。TE溶解，－20℃冻存。蛋白酶K、TE、50×TAE液、限制性内切酶A1w26I及与其配套使用的Buffer均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2.2 线粒体DNA目的片断的PCR反应 以外周血白细胞DNA为模板，应用Primer3软件在线设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的引物5’CCCTGATGAAGGCTACAAAGTAAGCGC 3’（nt 1278－1304）；R：5’CAGCTATC ACCAGGCTCGGTAGGTTT 3’（nt 2018－1993）扩增产物为741 bp。PCR反应体系为50μl，反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，65℃复性1 min，72℃延伸45 s，35个循环，反应终止后再72℃延伸10 min，4℃保存。取5μl进行2%琼脂糖电泳检测PCR产物。

1.2.3 Alw26I酶切分析 取PCR反应产物8μl，buffer 2 μl，Alw26I内切酶0.5μl，补充双蒸水至20μl，37℃水浴箱内消化120 min，以2%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

1.2.4 DNA序列测定验证 对于经酶切确定为阳性的病例，取相应的PCR产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序部完成，应用NCBI数据库BLAST在线比对测序结果，用DNAMAN软件将产物序列与标准序列比对，找出碱基改变的位点，分析突变情况。12Sr RNA标准序列参照：NC＿011137。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。维汉民族mtDNA A1555G突变的阳性率比较采用χ2检验，当理论频数＜1时使用Fisher确切概率法，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 限制性内切酶酶切结果 mt DNA 12Sr RNA A1555G突变使原存在于线粒体基因1552～1556位的Alw26I酶切位点消失。有这种突变的PCR片断，用Alw26I酶切后经琼脂糖电泳仍为一条带，而无此突变的扩增片断则被切割成278 bp和463 bp两条带（图1）。对所有酶切呈一条带的患者，再取PCR反应产物进行直接测序验证（图2）。

图1 PCR产物经Alw26I酶切分析检测mt DNA 12Sr RNA A1555G突变M：PCR分子量标准物（DL2000）；2、3、6、9、10：Alw26I酶切后的突变样品，其中2、3、6为汉族，9、10为维族；其余为Alw26I酶切后的无突变样品

2.2 基因突变检测结果 正常对照组中未检出mtDNA A1555G突变。163例耳聋患者中16例（9.82%，16／163）存在mtDNA A1555G突变，其中汉族12例（16.00%，12／75），维族4例（4.55%，4／88），汉族mtDNA A1555G突变检出率显著高于维吾尔族，差异有统计学意义（χ2＝6.001，P＝0.014）。这16例中，汉族8例有Am An应用史，维族有3例。

3 讨论

mtDNA突变是导致非综合征型母系遗传性聋的主要原因［6］，其突变还可以导致个体对致聋环境因素的易感性增加，其中以对Am An易感的mtDNA12Sr RNA A1555G点突变较为常见。1993年，Prezant等［7］首次证实线粒体DNA 12Sr RNA A1555G点突变与氨基糖苷类抗生素致聋患者的相关性，现在也已经证实mtDNA A1555G突变和氨基糖苷类药物诱发的耳聋密切相关［8］。本组患者中，16例存在mt DNA 12SrRNA A1555G突变者中即有11例有AmAn应用史。

在我国，氨基糖苷类药物性聋是导致新生儿先天性聋和成人后天性聋的主要原因之一，通过耳聋基因检测确定为mt DNA 12Sr RNA A1555G突变阳性的患者，根据线粒体母系遗传的特点，其所有母系家庭成员应终身绝对禁止使用Am An。这样，在明确病因的同时，大大降低了家族成员发生药物性聋的危险性。

图2 线粒体DNA1555位点序列分析箭头所指为mt DNA 12Sr RNA A1555G突变位点

mtDNA A1555G突变在不同国家发病情况不同，甚至同一国家不同地区、不同民族的发病也不同。这除了社会经济因素外，可能与不同的遗传背景有关。研究表明日本的NSHL患者中发现mtDNA A1555G突变的携带率为3.45%（11／319）［9］。欧洲中部德国、匈牙利、波兰320例NSHL中mtDNA A1555G突变有4人，携带率为1.25%［10］。北欧丹麦则为2.4%（2／85）［11］。Li等［12］在美国辛辛那提的NSHL儿童中发现A1555G携带率为0.6%（1／164）。戴朴等［3］在对中国不同省份特教学校的2 016例NHSL患者mt DNAA1555G突变筛查中发现阳性病例57例，检出率为2.83%。Malik等［13］在印尼的苏拉威西岛75名非综合征型聋患者中检测到A1555G阳性患者4例，A1555G携带率达5.3%，而刘晓雯等［14］报道甘肃A1555G突变阳性率为8.4%（67／802）。本研究显示本组新疆地区汉族和维吾尔族非综合征型性聋者mt DNAA1555G突变总阳性率为9.82%，而汉族阳性率相当高，达16%。分析其高检出率的原因主要是：①新疆地处祖国西北，属于贫穷落后地区，医疗条件和水平落后，缺医少药，Am An具有价格低廉、抗菌谱广、杀菌作用快等优点，其使用相对较广泛，在一定程度上提高了耳聋发生率，这些患者纳入调查后提高了这一基因突变的检出率；②也可能是人种、地域、气候及饮食习惯等因素共同引起了新疆A1555G突变的高发生率；③新疆作为一个特殊地区，环境因素可能参与较多，而氨基糖苷类抗生素诱发或加重耳聋的程度使环境因素在耳聋的发病方面显得更为突出［15］。线粒体单倍体型的不同也可能引起线粒体基因突变携带率的不同，进而导致不同民族发病率的差异；④自身存在的抽样误差也可造成维汉两民族不同的检出率。本研究样本量偏小，有待扩大样本量进一步研究。

因此，有必要应用基因诊断手段对高危人群或特定人群进行mtDNA A1555G突变的普遍性筛查，为存在mtDNA A1555G突变者提供早期诊断、早期干预、早期治疗方案及详尽的遗传咨询；并利用分子遗传学检测手段对于母亲孕期或新生儿进行mtDNA A1555G突变的筛查，提高非综合征型聋产前诊断的可能性，减少遗传性聋的发生，并为探索相应的基因治疗方法提供理论依据。在未来的很长一段时间，Am An还将在医疗水平滞后地区继续使用，所以预先发现对Am An耳毒性致聋的易感性个体就具有重要的现实意义。从本研究可以看出，mt DNA A1555G在新疆地区有较高的突变率，汉族高于维吾尔族，在中国新疆地区开展维汉两民族mtDNA 12Sr RNA A1555G突变的检测工作显得尤为重要。

1 Morton CC.Genetics，genomics and gene discovery in the auditory system［J］.Hum Mol Genet，2002，11：1 229.

2 谢鼎华，肖自安，叶胜难.遗传性聋分子病因研究进展［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2000，35：155.

3 戴朴，刘新，于飞，等.18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究（I）－GJB2 235de1C和线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变筛查报告［J］.中华耳科学杂志，2006，4：1.

4 王秋菊.关于非综合征型遗传性聋家系遗传学及听力学描述术语建议案［J］.中华耳科学杂志，2003，1：46.

5 贝政平，舒怀，周梁，等.眼耳鼻咽喉科疾病诊断标准［M］.第二版.北京：科学出版社，2007.201～202.

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12 Li X，Greinwald J，Yang L，et al.Molecular analysis of mitochondrial 12SrRNA and tRNASer（UCN）genes in pediatric subjects with nonsyndromic hearing loss［J］.J Med Genet，2004，41：615.

13 Malik S，Sudoyo H，Sasmono T，et al.Nonsyndromic sensorineural deafness associated with the A1555G mutation in the mitochondrial small subunit ribosomal RNA in a Balinesefamily［J］.J Hum 4Genet，2003，48：119.

14 刘晓雯，郭玉芬，韩东一，等.非综合征性聋患者线粒体DNA A1555G突变频率分析［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42：739.

15 王秋菊，韩明鲲，刘晓雯，等.值得关注的线粒体12SrRNA C1494 T突变——药物敏感致聋靶点［J］.听力学及言语疾病杂志，2008，16：446.

（2010－05－11收稿）

（本文编辑 周涛）

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.019

R764.44

A

1006－7299（2011）01－0061－04

△ 国家自然科学基金项目（30860358）、新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（200721117）资助

1 新疆医科大学附属中医医院耳鼻咽喉科（乌鲁木齐 830000）； 2 新疆医科大学2007级硕士研究生； 3 新疆医科大学基础医学院科研中心地方病分子生物学重点实验室

李彦华（Email：liyanhua1953＠126.com）