“综合修复法”在BrdU免疫组化染色中的应用

陈余朋，王行富，何观文

1.福建医科大学附属第一医院病理科（福建福州 350005）

2.福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科（福建福州 350005）

5－溴－2－脱氧尿嘧啶核苷（5－Bromo－2－deoxyuridine，BrdU)标记法因无放射性、污染小、敏感性强等优点，在肿瘤生物学、遗传学、分子生物学领域得到广泛应用。常用于研究细胞再生以及各种不同的因素对正常或肿瘤组织动力学的影响。然而不同的修复方法对该抗体的免疫组化检测结果影响较大，为此我们采用不同的修复PowerVisionTM二步法进行比较，包括酶修复、pH 6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复和微波修复、pH 9.0 Tris－EDTA高压修复和微波修复以及综合修复法，实验表明综合酶修复法的免疫组化染色最为敏感、定位准确和染色强。现报道如下:

1 材料与方法

1.1 取材和标本处理 采用放射线损伤小鼠嗅上皮动物模型15只，处死动物前2 h，腹腔注射Brdu 100 mg/kg。颈椎脱臼处死小鼠，剥皮断头，将整个头颅置4%多聚甲醛中固定20h，10%EDTA连续脱钙至细针能够轻松刺入组织，流水冲12 h，将头颅鼻腔段修剪成小块，常规脱水包埋制片，冠状位切片，每例嗅上皮样本连续切片7张，分7组进行免疫组化染色。

1.2 主要试剂 免疫组化一抗鼠单克隆抗体Brdu（clone:ZBU30)购自美国invitrogen公司;免疫组织化学检测试剂盒PowerVisionTMTwo－Step Histostaining Reagent购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Brdu粉末购自美国Sigama公司。

1.3 抗原修复方法

1.3.1 普通酶修复 将复合蛋白酶消化液50 μm加于切片组织上并完全覆盖，置于湿盒内，37℃温箱中消化10 min。

1.3.2 高压修复 将切片插入金属架，一组放置于盛有400ml0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0)的烧杯中，将烧杯放入高压锅内，待煮沸喷气后，计时2 min，然后自然冷却20 min取出切片;另一组置于盛有400 ml0.01 mol/L 的 Tris－EDTA（pH 9.0)烧杯中，余步骤同前一组。

1.3.3 微波修复 将切片插入塑料切片架，放置于盛有400ml0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0)的容器中，置微波炉内高火加热沸腾后，中低火恒温15 min。取出切片架自然冷却20 min;另一组置于盛有400 ml0.01 mol/L 的 Tris－EDTA（pH 9.0)容器中，余步骤同前一组。

1.3.4 综合修复 0.1%Triton X－100/0.1%柠檬酸钠（将0.1 g柠檬酸钠溶解于100 ml双蒸水中，再加入0.1 ml Triton X－100，混匀后置37℃水浴箱中孵育3 h)渗透，冰上孵育2 min，PBS洗涤3次，每次3 min;0.125%胰酶消化，室温孵育10～20 min，PBS平衡5 min，PBS洗涤3次，每次3 min;0.1 mol/L冷盐酸孵育10 min;2 mol/L盐酸37℃孵育30 min;0.1 mol/L四硼酸钠（Na2B4O7)室温下孵育10 min。

1.4 免疫组化方法 经上述步骤处理后的切片，PBS洗涤3次，每次3 min;加1∶50抗BrdU单克隆抗体，湿盒中37℃孵育2 h，PBS洗涤3次，每次3 min;加二抗，湿盒中37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，每次3 min;DAB显色3 min;自来水充分洗涤，苏木素复染;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0进行统计学分析，各组BrdU表达的比较采用卡方检验。

2 结果

BrdU特异结合于细胞核内DNA链上，故BrdU抗体免疫组化染色阳性表达定位于组织细胞核内。光镜下观察，小鼠嗅神经上皮细胞核显示出特异性的棕黄色，胞浆及其他背景着色均视为非特异染色。我们采用的不同修复方法，结果（表1)如下:（1)不修复组，1例出现非特异性染色，14例组织无染色;（2)酶修复组，1例局灶核阳性，5例非特异染色，9例不着色;（3)综合修复组，15例均为核染色，中等－强阳性（图1a);（4)pH 6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复组，3例非特异染色，12例无着色;（5)pH 9.0 Tris－EDTA高压修复组，12例非特异染色（图1b)，2例出现核染色（其中1例局灶着色)，1例无着色;（6)pH 6.0柠檬酸盐缓冲液微波修复组，2例非特异染色，13例无着色;（7)pH 9.0 Tris－EDTA微波修复组，9例非特异染色，3例出现局灶核染色，3例无着色。综合修复法效果稳定，BrdU免疫表达强、背景清晰，具有显著的敏感性，且均准确定位于细胞核，具有显著的特异性，与其他修复方法组比较具有显著的统计学意义（P＜0.01)。

表1 小鼠嗅神经上皮层BrdU的表达情况（例)

3 讨论

免疫组织化学是通过抗体和细胞内的抗原发生反应并被显色出来以供分析相应抗原的存在、定位或半定量。研究证实影响免疫组化的关键技术是抗原修复，抗原修复技术被誉为免疫组织化学技术的革命性突破。Sompuram等［1］采用合成的抗原多肽作为实验模型，结果证明甲醛所致的抗原丢失乃蛋白质分子内或分子间交联物所致，而抗原修复技术是打开交联的关键。而抗原修复技术效果的基本要素是加热条件及修复液的pH值。一般对大多数抗原而言提倡使用热修复法，尤其是核抗原经热修复后其染色效果特别好［2］。

图1 综合修复法与其它修复法效果比较

本实验所采用的体外掺入BrdU后显色，和普通抗原有所不同，BrdU作为胸腺嘧啶核苷的类似物，可以作为DNA合成的原料掺入到细胞中，处于S期（DNA合成期)的细胞，当有BrdU存在时，即掺入到新合成的双链DNA内，以氢链与腺嘌呤（A)结合，只要有0.5%的胸腺嘧啶被BrdU取代，就能用免疫组织化学技术检测出来［3］。因此，它有两个特点:一是BrdU（抗原)来自体外;二是BrdU这个抗原处于DNA的双链内。正是由于以上特点，使得该指标的检测具有特殊性，DNA双链内的抗原如果不经处理，或者处理不当，都将直接影响实验的结果［4］。本实验采用的酶修复、pH 6.0柠檬酸高压修复或微波修复和pH 9.0 Tris－EDTA高压修复或微波修复等方法都不能很好地暴露抗原，因此，如何充分暴露抗原成为实验的关键。

本实验中采用0.1%Triton X－100/0.1%柠檬酸钠渗透及胰酶消化两种方法叠加处理，以增加细胞膜的通透性，便于抗体进入细胞内;进入胞内的抗体，欲与DNA中的抗原结合，必需穿透染色体表面存在的阻挡，而染色体表面有一层核蛋白包绕，可用0.1 mol/L冷盐酸去除;暴露DNA后，抗原仍然“躲藏”在双链中，可采用2 mol/L的盐酸使DNA双链变性、解开;最后用Na2B4O7重建免疫组织化学所需的碱性环境，达到充分暴露BrdU的目的［5］，取得满意的效果，并具有很好的重复性。而单独使用常用的解链方法如盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，均未取得好的染色结果。

综上所述，采用Triton X－100/柠檬酸钠渗透、胰酶消化、0.1 mol/L盐酸去除染色体组蛋白、2 mol/L盐酸使DNA双链变性、Na2B4O7重建免疫组织化学所需的碱性环境的综合修复方法可以很好地暴露存在于DNA双链中的抗原，是一种实用且可靠的方法，具有很好的重复性。

［1］Sompuram SR，Vani K，Bogen SA.A molecular model of antigen retrieval using apeptide array［J］.Am J Clin Pathol，2006，125（1):91－98.

［2］Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et el.Antigen retrieval causes protein unfolding:evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit［J］.J Histochem Cytochem，2011，59（4):366－381.

［3］陈志宏，倪道凤，高扬，等.流感病毒感染后小鼠嗅觉神经元的凋亡与再生［J］.中国耳鼻喉颅底外科杂志，2004，10（6):324－326.

［4］Mathonnet M，Lalloue F，Pettit B，et al.Differential response of olfactory neurons to axotomy at embryonic and postnatal stages［J］.Neuroscience，2002，109（2):207－217.

［5］Shimada A，Shibata T，Komatsu K，et al.Improved methods for immunohistochemical detection of BrdU in hard tissue［J］.J Immunol Methods，2008，339（1):11－16.