结缕草根际联合固氮菌培养条件研究

2011-06-04张晓波

草原与草坪 2011年5期

张晓波，赵艳

（1.海南大学农学院/热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南儋州 571737；2.山西农业大学资源环境学院，山西太谷 030801）

联合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根际土壤中形成的特殊固氮作用，它们对植物生长有着一定的促进作用［1］。目前，水稻、玉米等禾本科作物根际固氮菌的研究较深入［2－13］，对于禾本科牧草固氮菌的研究较少。而近年来，草坪业在我国作为新兴产业，其发展速度日新月异，但化肥的大量使用严重影响了土壤结构，破坏了土壤的生态平衡，而固氮菌可以为作物提供氮素营养，并对促进生态系统中营养物质再循环，维持生物圈的正常功能起着重要作用。因此，固氮菌肥料在这一领域将会有广大的前景。

试验对结缕草（Zoysia japonica）根际土壤中分离到的5株固氮菌菌株的最适温度、最适pH值以及最佳通气量等条件进行研究，在上述基础上测定各个菌株的典型生长曲线，这些数据对有效地利用和促进菌株生长具有重要现实意义，可为生物菌肥的研制及禾本科植物菌肥的使用提供必要的理论数据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试菌株为从海南大学校内结缕草草坪根际土壤中分离、纯化，并经形态学、生理生化特性鉴定及固氮酶活性测定筛选得到的高效固氮菌株，菌株标记为N1、N4、N5、N6、N8共5株，供试菌株的鉴定已在《草原与草坪》2011年第1期上发表，见参考文献［14］，其固氮酶活性为194.5C2H4nmol/（mL·h）（N8）～215.4C2H4nmol/（mL·h）（N1）。

培养基为LB液体培养基［15］。

1.2 试验设计

试验均以未接菌的LB液体培养基为空白对照。

1.2.1 温度条件对菌株生长的影响按2%接种量分别将菌株接种到LB液体试管培养基中，每个菌种接种4管，分别于10、15、20、25、30、35、40、45℃振荡培养（180r/min）48h，然后测定每个菌株的OD600nm吸光值，并计算平均值，以确定各菌株的最适生长温度。以OD600nm吸光值为纵坐标，温度为横坐标，生成坐标图。

1.2.2 初始pH对菌株生长的影响将菌株按2%接种量分别接种到pH 为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液体试管培养基中，每个菌种接种4管，置于180r/min 28℃的振荡培养箱中培养48h，然后测定其OD600nm的平均吸光值，确定每种菌株的最适生长pH值。以OD600nm吸光值为纵坐标，pH为横坐标，生成坐标图。

1.2.3 通气条件对菌株生长的影响将菌株按5%的接种量接种到装液量为30、50、100、150和180mL的三角瓶（250mL）中，28℃振荡培养（180r/min）48h后测定OD600nm的平均吸光值。确定每种菌株的最佳需氧量。以OD600nm吸光值为纵坐标，通气量梯度为横坐标，生成坐标图。

1.3 典型生长曲线的测定

将各菌株分别从保存的试管斜面上取一环接种于10mL液体LB培养基中，于28℃，150r/min振荡培养12h作为种子液。

按2%的接种量将种子液接种于200mL LB液体培养基中，振荡混匀，以每支10mL分装于标记为0、2、4、6、8、10、12…24h的13支试管中，于每个菌株的最适培养条件下培养。按标记时间从上述试管中各吸取l mL培养液，加入9mL灭菌生理盐水，混匀后取出1mL加入下一支9mL无菌的生理盐水中，依次类推，对菌液作10倍梯度稀释，稀释度为10－1、10－2、10－3直到10－10，分别吸取各稀释度菌液0.1mL涂布LB平板，3次重复，于每个菌株的最适温度培养48h。计数菌液不同稀释度的3次重复的菌落数，菌落数在30～300的为有效平板，求其平均值。计算出供试菌株各生长时间的菌数。

2 结果与分析

2.1 温度对菌株生长的影响

5株固氮菌株在10～45℃的温度均能生长（图1），最适宜的生长温度为20～30℃，菌株的最适温度存在差异，即菌株N1在30℃时，菌株N4、N6、N8在25℃时，菌株N05在20℃时，对应其最高的OD600nm吸光值达到显著水平（P＜0.05），OD600nm吸光值最高，即该温度分别对应各菌株的最适生长温度。

图1 温度条件对菌株生长的影响Fig.1 The effect of temperature on growth of strains

2.2 初始pH值对菌株生长的影响

从结缕草根际土壤中分离到的5株固氮菌株均能在pH 4.0～9.0生长，表明这些菌株对pH具有相对较广的适应能力。各菌株的最适pH存在差异，即菌株 N1、N4、N6、N8最适初始pH 为7.0，N5为7.5吸光值达到显著水平（P＜0.05），说明这5个菌株在初始中性或稍偏碱性的条件下生长较好。

图2 pH值对菌株生长的影响Fig.2 The effect of pH on growth of strains

2.3 通气条件对菌株生长的影响

从图3可以看出，根据试验中各菌株最适通气量的测定，菌株 N04、N05、N06、N08通气量为220mL时生长最好（吸光值达到显著水平，（P＜0.05），说明越高的氧分压越有利于菌株的生长；菌株N1在通气量为200mL时最适宜其生长，吸光值达到显著水平，（P＜0.05），但在通气量为220mL时它们生长受到一定的阻碍。

2.4 典型生长曲线

由各个菌株的典型生长曲线可以看出，N1、N6菌株经过一个短暂的0～2h的延迟期，于2～14h时进入对数期，稳定期为14～18h，18h后进入衰亡期；菌株N4、N5经过0～2h的延迟期后，于2～16h进入对数期，16～20h进入稳定期，20h后进入衰亡期；菌株N08经过0～4h的延迟期后，于4～18h进入对数期，18～20h进入稳定期，20h后进入衰亡期。由以上分析可以看出，筛选到的菌株均具有比较明显的延迟期、对数期、稳定期以及衰亡期。

图3 通气条件对菌株生长的影响Fig.3 The effect of oxygen conditions on growth of strains

图4 菌株典型生长曲线Fig.4 The typical growth curves of strains

3 讨论与结论

（1）前人研究表明，微生物在人工培养时直接受温度条件的影响，适宜的培养温度对微生物生长具有很大的促进作用［16］。汤春梅［17］以甘肃省东祁连山高寒地区禾本科牧草根际分离、筛选获得的固氮菌株N4、X5、C－6、Dry6为材料，对其所需培养条件进行了研究，结果表明菌株X5、C－6最适温度为30℃，Dry6最适温度35℃，N4最适温度25℃；张丽梅［18］对固氮菌株W12进行培养条件研究，试验结果表明，该菌株的最适生长温度为30℃；试验中，菌株N1的最适温度为30℃，与汤春梅［17］、张丽梅［18］研究的结果较为一致；菌株N4、N6、N8最适温度为25℃，与汤春梅研究固氮菌株N4结果较为一致［17］。

（2）在微生物人工培养过程中，适合的初始pH值往往对该微生物本身及发酵生产在初期就产生促进作用，对于某种有益特定微生物种类来说，找到其发酵的最适初始pH值并应用，是工业培养及发酵生产过程中的一项重要措施之一。汤春梅［17］对固氮菌株N4、X5、C－6、Dry6进行了研究，结果表明，C－6初始pH 7.5时，X5初始pH 7.5～8.0时，N4、Dry6初始pH 8.0时，菌株的活菌数达最高。张丽梅［18］对固氮菌 W12菌株的研究结果则表明，最适初始pH为5.0～6.0。蒋玮等［19］对固氮菌株HY1141进行了最佳培养条件研究，结果表明，培养基最适初始pH为7.0。试验结果表明，菌株N04最适初始pH为7.5，与汤春梅［17］研究的菌株C－6结果较为吻合；菌株N1、N5、N6、N8最适初始pH值为7.0，与蒋玮等［19］研究结果较为吻合，而与汤春梅［17］、张丽梅［18］研究的结果有一定差异。

（3）微生物对氧的需要和耐受能力在不同的类群中差别很大，所以在微生物人工培养过程中，通气量也是一个关键的影响因素。目前，固氮菌通气量的研究较少，在此次研究中，菌株N4、N5、N6、N8最适通气量为220mL，菌株N01最适通气量为200mL。这些数据可以对将来菌株的生产发酵提供一定的指导。

（4）利用典型生长曲线可以看出不同微生物在培养过程中进入延迟期、对数期、稳定期及衰亡期的时间，所以，根据典型生长曲线可以明确微生物的生长规律，对生产实践具有重大的指导意义。有些学者已经对一些特异微生物的生长曲线进行了初步的研究，如李木桂等［20］对筛选出的3株溶藻菌L7，L8和L18进行了生长曲线的研究；陶令霞等［21］对固氮菌NT06的生长曲线进行了测定，试验测定了从结缕草根际土壤中筛选的5株固氮菌的典型生长曲线，发现除菌株N08（延迟期为0～4h）外，其余4个菌株延迟期均为0～2h，但进入对数生长期以后所持续的时间也有所不同，菌株N1、N6为2～14h；菌株N4、N5为2～16 h，相比N1、N6延长了2h；相应地，N4、N5进入稳定期的时间又比N1、N6推迟了2h（16～20h）；菌株N8于4～18h进入对数期，18～20h进入稳定期。菌株N1、N6 18h后进入衰亡期，菌株N4、N5、N8 20h后进入衰亡期。说明不同菌株的生长发育特性有一定的差异，这些数据对今后菌株的生产及利用具有重要意义。

［1］James E K，ReisV M.Infection of sugar cane by the associative nitrogen－fixing bacterium Acetobater diazatrophicus［J］.Journal of Experimental botany，1994，45（275）：757－766.

［2］尤崇杓，丘元盛.粪产碱菌与水稻幼苗的联合固氮作用［J］.中国农业科学，1982（6）：1－5.

［3］张跃林.粪产碱菌A215与水稻根的结合作用［J］.植物生理学通讯，1984（6）：32－34.

［4］Hafeez F Y.生物肥料在农业可持续发展中的应用前景［J］.草原与草坪，2003（2）：10－13，18.

［5］王子芳，曾宽容，扬一平.水稻根表固氮的研究［J］.微生物学通报，1987，14（6）：241－243.

［6］丘明祺，卢秋雁，朱红惠，等.耐氨固氮菌分泌物对水稻秧苗生长的影响［J］.微生物学通报，2002，29（4）：1－4.

［7］姚拓.促进植物生长菌的研究进展［J］.草原与草坪，2002（4）：3－5.

［8］海伟力，王耀东，尤崇邵.水稻根际联合固氮细菌的研究［J］.微生物学报，1993，33（2）：79－85.

［9］崔宗均，苏宝林，海伟力，等.北方水稻田固氮细菌资源的研究［J］.中国农业大学学报，1996（3）：64－80.

［10］湖北省微生物研究所生物固氮组.玉米根际联合固氮细菌的研究［J］.微生物学报，1979，19（2）：160－165.

［11］张宏，宋明芝，刘淑环.玉米根际固氮活力的研究［J］.吉林农业科技，1980（1）：70－75.

［12］李永兴，王继文，李久蒂，等.玉米根际联合固氮菌5727菌株的基本特性的研究［J］.微生物学报，1993，33（6）：151－158.

［13］Rao A V，Venkateswarlu B.Cereal Nitrogen Fixation［M］.India：International Crops Research Institute for the Semi－Arid Tropics Patancheru，1986：37－41.